储粮害虫磷化氢抗性检测设备及应用研究

单常尧 曹 阳 陈 鑫 何 晓 王莉君 张 涛

(河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001) (国家粮食和物资储备局科学研究院2，北京 100037) (杭州贝斯特气体有限公司3，杭州 311404)

磷化氢作为粮食熏蒸剂有很多优势，比如它具有很高的熏蒸效率，还具有挥发性好、杀虫毒力高、扩散速度快、基本无残留且不影响谷物品质和种子活力、价格低廉、使用方便等特点[1]。昆虫的耐药性是指昆虫首次接触某种杀虫剂所表现出的抵抗能力。也称为天然抗性。多次不规范用药易产生抗药性。粮食行业长期单一且不规范地使用磷化氧，加速了储粮害虫对磷化氢的抗性，最终导致害虫对磷化氢的抗药性越来越严重[2]。科研人员对磷化氢的杀虫机理和毒理学机制进行深入的研究，为科学使用磷化氢提供了理论基础[3,4,5]，但储粮害虫磷化氢抗性的出现仍然是防治环节不可忽视的难题[6]。

传统的磷化氢抗测定(FAO推荐抗性测定方法)过程复杂、耗时长，且制得的磷化氢气体浓度精确性不高，对实验人员和实验条件要求都比较严格，在实际应用中存在很多问题，不利于基层操作[7,8]。为解决抗性测定过程中操作繁琐、实验耗时的问题，课题组对近年来我国主要储粮害虫对磷化氢的抗性测定方法进行了研究。研发了磷化氢抗性测定设备，为进一步验证设备的性能，本实验用抗性问题较为严重的锈赤扁谷盗作为试虫，进行了击倒和熏蒸实验(FAO推荐方法)[9]。

1 材料与方法

1.1 试虫和培养方法

实验所涉及每个品系的锈赤扁谷盗均已经过国家粮食与物资储备局科学研究院储运所储粮害虫饲养实验室纯化培养数十代。锈赤扁谷盗培养于实验室恒温恒湿培养箱中32 ℃、78%RH、24 h无光照条件下。取数百头成虫，投入装有饲料的500 mL玻璃瓶中，产卵3 d后筛出成虫，放入另一个准备好的玻璃瓶中饲养，然后将带卵的小麦放回原瓶内置于培养箱中饲养，每3 d一批，待其子代发育到成虫后，挑选2周龄的成虫作为实验用虫。于文江等[10]报道在温度32 ℃、相对湿度75%～90%件下，卵发育到成虫的羽化时间为20.3 d到27.5 d。

每种试虫按国家粮食和物资储备局科学研究院储运所的标准化方法进行培养。粉食性害虫以全麦粉∶燕麦片∶酵母∶碎麦=5∶3∶3∶1的配比为饲料进行饲养，在温度(30±2)℃，相对湿度(75±5)%的条件下培养。

1.2 实验材料和设备

磷化氢钢瓶气体；磷化氢抗性测试设备由国家粮食和物资储备局科学研究院提供；熏蒸瓶(50 mL)；试虫培养箱；磷化氢气体报警仪；恒温干燥箱；小毛笔；培养皿；害虫分选筛；漏斗。部分设备和器材如图1所示。

所述储粮害虫磷化氢抗性检测设备包括主管路、并联管路、净化管路和气源管路，管路上连接有观察装置、气体探测装置、滤毒罐和净化装置等，工作原理主要包括4个阶段，即N2吹扫阶段、PH3/空气测试阶段、高/低浓度PH3探测阶段和尾气净化阶段[11]。

图1 主要设备和器材

1.3 实验方法

1.3.1 锈赤扁谷盗各品系抗性水平确定

WINKS等[12]曾报道在一定磷化氢浓度下，储粮害虫产生保护性昏迷的时间长短与其磷化氢的抗性程度有密切关系。Waterford等[13]研究通过研究赤拟谷盗发现的储粮害虫致死时间与保护性昏迷的时间呈正相关。曹阳等[14，15]报道可通过害虫击倒时间快速判定害虫是否产生抗性及抗性等级。这些结果表明储粮害虫磷化氢保护性昏迷(击倒效应)与致死效应具有一致性。基于以上研究，本实验采用曹阳等[14]研究的半数击倒时间的方法确定储粮害虫的抗性品系与敏感品系及其抗性程度，并记录其半数击倒时间(KT50)。

首先从准备好的试虫中挑出同一品系同一世代的储粮害虫成虫10头放入熏蒸瓶内，置于磷化氢抗性测定设备中，将设备接通预先配好的磷化氢气体浓度为2.0 mg/L的钢瓶，每个实验重复3次并设置对照实验，观察试虫反应情况。当熏蒸瓶中的锈赤扁谷盗不能正常爬行或者出现痉挛反应[16]，只有触角能偶尔动弹则视为被磷化氢击倒(Konckdown)，将试虫接触磷化氢气体开始到试虫被击倒的时间称为击倒时间(Konckdown Time,简记为KT)。观察并记录第5头被磷化氢击倒的时间为半数击倒时间(KT50)[15]。

1.3.2 锈赤扁谷盗各品系抗性倍数测定

参照FAO(1975)推荐的熏蒸剂毒力测定方法，根据段锦艳等[17]提供的数据锈赤扁谷盗抗性鉴别浓度0.064 mg/L，设定熏蒸浓度梯度为0.060、0.050、0.040、0.030、0.020 mg/L，另外为保证实验的可靠性增设2倍抗性鉴别浓度0.120 mg/L[18]。将50头体型相似且健壮的成虫放入事先准备好的熏蒸瓶中，每个浓度设2个平行，另外每个品系设置对照(以未经磷化氢处理的试虫作为空白对照)，重复2次。将熏蒸瓶置于设定条件下(25 ℃、(70±5)%RH)密闭熏蒸20 h，散气后取出试虫，加入适量饲料，保持在25 ℃，(70±5)%RH的培养条件下继续培养14 d记录害虫死亡数量(判断死亡标准为使用毛笔或解剖针触动时只有轻微肢体抽动则判断为死亡)，并计算死亡率、矫正死亡率和LC50值 ，对照组中若有死虫出现，则通过Abbots公式校正，如果对照组死亡率大于10%需重新安排实验，若低于5%则可不必较正[19,20]。

1.4 数据处理

实验成虫击倒快速测定的实验结果用Microsoft Excel 2016进行记录整理，毒力测定的实验结果采用Statistical Product and Service Solutions(SPSS)22.0和R-3.5.2进行处理分析，得到不同品系的毒力回归方程和抗性系数。

其中：Rf(抗性系数)=(处理品系LC50/(敏感品系LC50)

Abbots:校正死亡率=

2 结果分析

2.1 锈赤扁谷盗各品系的磷化氢半数击倒时间

磷化氢抗性击倒快速测定的试验结果得到的半数击倒时间如表 1所示。

表1 各个品系的锈赤扁谷盗成虫的半数击倒时间 KT50

当测定品系KT50值大于30 min时,为抗性品系害虫;当测定品系KT50值小于30 min时，为敏感品系害虫[15,]。

实验结果表明4个品系的锈赤扁谷盗均为抗性品系，其中内蒙古通辽的品系所需击倒时间比较短，基本接近敏感品系，其他3个品系的锈赤扁谷盗已经具有比较高的抗性。实验结果表明在粮食流通不频繁储粮环境较稳定的通辽地区的锈赤扁谷盗对磷化氢的抗性并不严重，而其他3个地区的锈赤扁谷盗对磷化氢的抗性则相对比较严重。

2.2 锈赤扁谷盗各品系抗性倍数

FAO推荐方法测定的4个品系的锈赤扁谷盗的磷化氢抗性倍数实验数据经过进行处理，结果如表2所示。

表2 不同品系锈赤扁谷盗的磷化氢抗性倍数测定

注：磷化氢的浓度由1 mg/L 换算mL/m3的系数按730计；锈赤扁谷盗各品系的抗性系数Rf=待测品系LC50值/FAO推荐敏感品系的LC50值(锈赤扁谷盗对磷化氢的敏感数值以通辽品系的进行参考)。

敏感品系的致死中浓度参照严晓平等在“我国主要储量害虫抗性调查研究”中提到的敏感品系的LC50=0.011 mg/L为基准(FAO推荐的敏感品系LC50值范围为0.007～0.013 mg/L[22])。从表2数据中可以看出内蒙古通辽品系属于低抗性、接近敏感品系，其他3个品系(费县、南宁、广州)的锈赤扁谷盗均已具有较高的抗性。致死中浓度LC50值为内蒙古通辽(0.041 mg/L)<广西南宁(0.407 mg/L)<山东费县(0.418 mg/L)<广东广州(0.500 mg/L)，半数击倒时间KT50值为内蒙古通辽(45 min)<广西南宁(170 min)<山东费县(174 min)<广东广州(187 min)，抗性系数Rf值为蒙古通辽(3.727)<广西南宁(36.727)<山东费县(38.000)<广东广州(45.455)，由此可见LC50与Rf、KT50的值均呈正相关关系。利用SPSS 22.0得出的内蒙古通辽、广西南宁、山东费县、广东广州4个品系的LC95分别为0.106 mg/L、1.994 mg/L、1.816 mg/L、2.737 mg/L，但所求结果LC95的95%置信区间均较宽，仅内蒙古通辽品系的可靠性较高，因此本实验所得的LC95值并不适宜判断害虫的抗性程度，仅具有参考价值，造成该现象的原因可能是有效样本数量不够，高死亡率对数值变异程度影响过大或存在除磷化氢浓度以外的其他重要因素影响害虫死亡年率。

2.3 锈赤扁谷盗各品系剂量浓度与死亡几率值的对应关系

将设定的磷化氢浓度进行对数转换，利用NORMSINV函数求得四个品系锈赤扁谷盗死亡几率值，通过R语言ggplot2进行线性回归，绘制浓度对数-死亡几率值回归直线，结果如图2所示。(注：若该浓度下死亡率为0，则舍弃该点)

通过回归直线可以从图中直接得到lg(LC50)值，来比较抗性程度，但该值尚不足以反应各品系之间的差异(由于费县、广州、南宁品系的抗性较强，lg(LC50)值较大，因此图中无法完全显示)。毒力回归方程Y=a+bX中的b值代表分散程度的大小，其中b值越大，直线坡度越大，则分散程度越小，该品系对对熏蒸剂反应越均匀，反之则说明该品系有较大的异质性，即个体之间抗性差异较大。

图2 浓度对数-死亡几率值与锈赤扁谷盗 对磷化氢的毒力回归直线

根据毒力回归方程可以发现b值的大小为内蒙古通辽(3.939)>山东费县(2.578)>广西南宁(2.393)>广东广州(2.228)，抗性品系的分散程度类似，但均低于敏感品系。分析原因可能为：抗性品系杂合程度较高，存在极端个体；在试虫挑取过程中未分辨雌雄，存在性别对于抗性的影响；成虫体型差异的影响；样本量不大，无法消除测定过程的随机误差。

2.4 锈赤扁谷盗各品系lg(KT50)与lg(LC50)的相关性

将四个品系的锈赤扁谷盗的 KT50和 LC50的值进行对数转换与回归分析，运行R语言进行回归分析，并利用ggplot2将分布点映射至图像展示区域，即对分布点进行可视化，结果如图3所示。

表3 各品系锈赤扁谷盗实验结果

图3 锈赤扁谷盗各品系的lg(LC50) 与lg(KT50)的相互关系

4个品系击倒时间的顺序为广东广州>山东费县>广西南宁>内蒙古通辽，抗性倍数的顺序为广东广州 >山东费县 >广西南宁>内蒙古通辽。可见不同品系锈赤扁谷盗lg(LC50)与lg(KT50)的匹配度较高，且呈直线相关。因此KT50值可以在很大程度上反映抗性水平，甚至可以在测得害虫半数击倒时间KT50的基础上利用回归方程来推算出致死中浓度LC50，进而预测出该种害虫的抗性水平。

从图3可以看出，不同品系的锈赤扁谷盗的lg(LC50)与lg(KT50)之间具有一定的相关性，其回归方程的决定系数即R2为0.999 6，拟合度相对较好，其回归方程为y= 1.735x-4.257。曹阳、王殿轩等[14,15]研究的结果相吻合，表明通过抗性测定装置确定的LC50与KT50值准确可靠，可以利用其对害虫抗性水平进行快速检测。

3 讨论

根据害虫的抗性水平针对性的制定熏杀方案，是合理有效控制抗性害虫的关键。FAO推荐的抗性测定方法是目前公认的最为准确的抗性测定方法，以熏蒸结束14 d的数据和已知敏感(参考)品系LC50为基线而确定，因此无法直接测定抗性水平，同时易受极端(极敏感或极高抗)品系的影响，而且测定过程复杂且耗时过长，难以应用于实践。Waterford等[13]与曹阳等[14]研究表明可以采用击倒50%成虫的时间KT50代表这种害虫的抗性水平，虽然该值有效的规避了极端品系的影响，可以较好的反应集中趋势，但磷化氢浓度的控制是决定该方法测定结果准确的重要因素。

针对以上两种传统方法存在的缺陷，本研究提出一种抗性测定装置的方法：1)本装置针对不同需求，提供两种抗性测定模式，即实验室抗性水平精确测定(FAO推荐方法)和紧急熏蒸预案制订(半数击倒时间测定)模式，使之既可以准确测定抗性水平又可以短时判断抗性水平；2)该装置采用钢瓶装磷化氢气体作为气源最大限度地保证了磷化氢浓度的精准，无需气体制备及浓度检测环节，使操作过程尽可能简化；3)可以同时进行3组实验，有效规避了环境及人为因素造成的影响，最大限度的保证实验平行并提高实验效率；4)磷化氢浓度报警仪对每一时刻环境中磷化氢浓度进行实时监控，以确保装置气密性良好无泄露，保证操作环境安全；5)设有尾气吸收装置，使磷化氢气体不进入大气，不会造成尾气污染。

4 结论

本实验分别对三个储粮生态区4个品系的锈赤扁谷盗进行抗性测定，实验结果表明4个品系的半数击倒时间KT50值与抗性倍数Rf值呈正相关关系；通过对不同品系的锈赤扁谷盗的lg(LC50)与lg(KT50)进行线性回归，发现两变量之间的决定系数R2为0.999 6、P值为0.000 186 7，表明变量之间相关性较强且具有极显著的线形相关性；不同储粮生态区之间的锈赤扁谷盗的磷化氢抗性存在差异，同一储粮生态区不同品系之间抗性也存在差异；从储粮生态区的特点来说，低温储粮生态区(内蒙古通辽)储藏难度较小，害虫抗性程度也低于中高温储粮生态区(山东费县、广西南宁、广东广州)，与文献中所述储粮的难易程度和抗性水平高低一致的结论相符。以上通过抗性测定装置和方法得到的关于锈赤扁谷盗磷化氢抗性的结论符合实际情况且存在理论支撑，因此证明该装置所得数据的准确可靠，能够实现储藏过程中害虫抗性的快速、准确测定，不仅适用于FAO推荐抗性测定方法抗性倍数Rf的测定也对现场熏蒸或制定应急熏蒸预案过程中判断抗性程度具有参考意义，是一种多用途、高准确度的高效测定装置和方法。