基于清风藤属植物DNA条形码的叶绿体序列筛选

严福林， 温 迪， 王 波， 徐文芬， 孙庆文， 魏升华

(贵州中医药大学药学院， 贵阳 550025)

清风藤属(SabiaColebr.)在我国约有16种、5亚种、2变种，主要分布于我国西南部和东南部，以贵州、云南、广西等西南地区分布较为广泛，种类较多。研究表明，我国西南地区可能是清风藤属植物的分布中心与起源中心[1-4]。据调查，清风藤属植物多为药用，以小花清风藤尤甚，药用较为广泛，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有清热利胆汁、祛风止痛等功效，常用于治疗肝炎、风湿痹痛、跌打损伤等疾病，为贵州苗族、布依族等少数民族常用药[5-7]，以小花清风藤为主要原料的龙华清肝冲剂、花栀清肝颗粒、胆炎康胶囊等成方制剂与诸多茶饮等产品均具有较好的产业基础与市场前景。诸多研究表明，清风藤属多种植物主要含有黄酮类、生物碱类及三萜类成分[8-10]，具有显著的抗乙肝病毒、保肝、降酶、抗炎等作用[11-13]。此外，清风藤属植物还具有较好的生态保护和园艺观赏价值，开发利用前景广阔。

前期的研究发现，清风藤属植物花期较短，花瓣易脱落，果实较少，标本往往缺乏重要的鉴定器官，给该属植物和药材的鉴别带来了诸多挑战。目前，该属植物的鉴别仍然依靠经验丰富的专家鉴定，相关研究较少[14-16]。因此，探求一种全新的既准确简便又行之有效的方法是鉴别该属植物迫切需要解决的问题。

DNA条形码技术具有准确性高，受到发育阶段和生长环境的影响小、样品用量小、快速简便等优点，是近年植物系统与鉴定学研究的热点，为小花清风藤的鉴定提供了一种行之有效的新思路[17,18]。被子植物叶绿体基因为母系遗传，具有遗传保守，变异适中等优点，广泛应用于植物的亲缘关系、系统演化、分类鉴定等研究[19]。matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列为国际生命条形码联盟(CBOL)推荐的部分重要的候选序列[20]。本研究选取叶绿体基因matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列，对清风藤属9个物种共48个样品进行DNA条形码技术可行性分析，以筛选适合清风藤属鉴别的DNA序列，为清风藤属植物资源的鉴定、保护与合理开发利用提供参考。

1 实验材料

本研究采集到贵州省、云南省、重庆市、台湾省4个地区9种清风藤属植物，共计48份样品。样品对应标本均由贵州中医药大学孙庆文教授鉴定，凭证标本存于贵州省生药重点实验室标本室，材料信息详见表1。

表1 试验材料信息

种名编号样品数采集地点采集时间(年-月-日)小花清风藤(S. parviflora)XP1普安县龙吟镇2015-10-03XZ5镇宁县黄果树镇2014-10-06XW5望谟县种植2016-11-07XX2兴义市马岭河峡谷2014-10-15四川清风藤(S. schumanniana)SS5贵阳市水田镇2015-07-24云南清风藤(S. yunnanensis)YQ5大理市苍山清碧溪2015-05-17尖叶清风藤(S. swinhoei)JZ7贵州省正安县2015-08-20平伐清风藤(S. dielsii)PD5贵州省大方县2015-07-01鄂西清风藤(S. campanulata) subsp. ritchieaeED3独山县兔场镇2015-08-03灰背清风藤(S. discolor)HZ7紫云县猴场镇2014-09-20阿里山清风藤(S. transarisanensia)AT1中国台湾阿里山2016-04-21簇花清风藤(S. fasciculata)DS2独山县紫林山2016-08-07

2 实验方法

2.1 样品DNA的提取与扩增

取硅胶干燥的样品叶片约20 mg，根据试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)操作手册提取样品总DNA样本。用于扩增的引物(matK、psbK-psbI、psbA-trnH)由上海生工生物工程股份有限公司(上海生工)设计合成。总DNA均采用50μL扩增(PCR)体系，引物正反序列各2μL、样品总DNA 2μL、2×Taq PCR MasterMix 24μL、加ddH2O补足50μL。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一且清晰的PCR产物送上海生工纯化并测序。引物与PCR程序详情见表2。

表2 引物以及扩增程序

条形码序列引物名称碱基序列(5'-3')扩增程序matKKIM-3FKIM-1RCGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAGACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC94℃,4min;94℃,30s;51℃,40s;72℃,1min;35cycles;72℃,7minpsbK-psbIpsbKpsbITTAGCCTTTGTTTGGCAAGAGAGTTTGAGAGTAAGCAT94℃,4min;94℃,30s;51℃,40s;72℃,1min;35cycles;72℃,7minpsbA-trnHpsbAtrnHGTTATGCATGAACGTAATGCTCCGCGCATGGTGGATTTCACAATCC94℃,5min;94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min;30cycles;72℃,7min

2.2 数据分析

测序峰图使用Codon Code Aligner v 8.0.2软件(Codon Code Corp，Barnstable，MA，USA，http://www.codoncode.com)进行校对拼接，去除引物区和低质量序列。采用MEGA v 5.0[21]软件进行多序列比对，统计分析各序列的碱基组成(GC含量、变异位点、保守位点和信息位点)，基于Kimura 2 Parameter(K-2-P)模型计算种内、种间遗传距离并加以分析，通过绘制各候选片段的Barcodinggap图，评价各候选序列的种内和种间的变异情况[22]。利用SPSS v 22.0(SPSS version 22.0, IBM Corp., USA)中的Wilcoxon秩和检验对单一序列的种内、种间变异进行评价；选用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树，相似比对搜索法考察鉴定效率。

3 实验结果

3.1 序列特征分析

3条叶绿体基因序列在48份清风藤属植物PCR扩增成功率均为100%，序列测序成功率：psbA-trnH与psbK-psbI序列为100%，matK序列为88.10%。matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列经多序列比对后有效长度分别为820 bp、421 bp、478 bp，GC含量分别为36.5%、36.5%、29.7%，保守位点数分别为805、404、414个，变异位点数量分别为14、5、46个，信息位点数分别为13、4、32个。

3.2 种内、种间变异分析

遗传距离分析结果显示，matK序列仅有鄂西清风藤的种内遗传距离为0，种内遗传距离小于种间遗传距离的有：灰背清风藤、鄂西清风藤与小花清风藤，其余种类种内遗传距离大于其种间遗传距离。psbK-psbI序列小花清风藤、平伐清风藤、灰背清风藤、鄂西清风藤种内遗传距离为0；四川清风藤与云南清风藤种内遗传距离大于其种间遗传距离。psbA-trnH序列平伐清风藤、鄂西清风藤种内遗传距离为0，仅有四川清风藤种内遗传距离大于其种间遗传距离。种间和种内遗传距离统计结果显示，psbA-trnH的种间遗传距离最大为0.036 1±0.022 5，psbK-psbI序列种间变最小为0.005 1±0.003 2；种内变异大小顺序为：psbA-trnH>psbK-psbI>matK。总体看，只有psbA-trnH序列种内最大变异小于种间最小变异。综合每条候选序列的种内和种间的遗传距离变异情况，psbA-trnH序列在清风藤属植物中的变异程度较高(表3～表6)。

表3 各候选序列种内、种间差异比较

变异类型matKpsbK-psbIpsbA-trnH种内变异0.0021±0.00310.0029±0.00210.0126±0.0172平均种内变异0.0012±0.00210.0009±0.00130.0068±0.0086种内最大变异0.0029±0.00450.0027±0.00390.0022±0.0276种间变异0.0058±0.00390.0051±0.00320.0361±0.0225平均种间变异0.0047±0.00210.0043±0.00180.0309±0.0118种间最小变异0.0008±0.00130.0009±0.00140.0035±0.0052

表4 清风藤属matK序列种内和种间平均遗传距离

物种名称小花清风藤尖叶清风藤四川清风藤云南清风藤平伐清风藤灰背清风藤鄂西清风藤簇花清风藤小花清风藤0.0010±0.0008尖叶清风藤0.0096±0.00270.0074±0.0020四川清风藤0.0051±0.00220.0067±0.00190.0025±0.0011云南清风藤0.0036±0.00190.0071±0.00210.0017±0.00070.0006±0.0004平伐清风藤0.0086±0.00300.0099±0.00280.0057±0.00200.0050±0.00210.0021±0.0007灰背清风藤0.0087±0.00310.0103±0.00290.0058±0.00220.0050±0.00220.0012±0.00040.0004±0.0001鄂西清风藤0.0033±0.00190.0069±0.00060.0014±0.00060.0003±0.00020.0052±0.00220.0053±0.00240.0000簇花清风藤0.0171±0.00150.0042±0.00260.0031±0.00210.0004±0.00100.0024±0.00120.0011±0.00060.0021±0.00110.0000阿里山清风藤0.0034±0.00200.0069±0.00060.0014±0.00060.0003±0.00020.0054±0.00230.0054±0.00240.0011±0.00030.0011±0.0003

注：阿里山清风藤只有1份样品。下同。

表5 清风藤属psbK-psbI序列种内和种间平均遗传距离

物种名称小花清风藤尖叶清风藤四川清风藤云南清风藤平伐清风藤灰背清风藤鄂西清风藤小花清风藤0.0203±0.0053尖叶清风藤0.0360±0.00710.0139±0.0040四川清风藤0.0300±0.00640.0557±0.01050.0185±0.0035云南清风藤0.0317±0.00650.0500±0.00920.0140±0.00250.0078±0.0022平伐清风藤0.0399±0.00830.0619±0.01150.0275±0.00750.0333±0.00780.0000灰背清风藤0.0406±0.00840.0627±0.01160.0280±0.00760.0338±0.00790.0004±0.00040.0008±0.0005鄂西清风藤0.0279±0.00650.0548±0.01060.0042±0.00120.0104±0.00200.0246±0.00780.0251±0.00860.0000阿里山清风藤0.0353±0.00750.0616±0.01110.0116±0.00430.0175±0.00450.0313±0.00780.0323±0.00880.0073±0.0041

表6 清风藤属psbA-trnH序列种内和种间平均遗传距离

物种名称小花清风藤尖叶清风藤四川清风藤云南清风藤平伐清风藤灰背清风藤鄂西清风藤簇花清风藤小花清风藤0.0000尖叶清风藤0.0027±0.00200.0022±0.0015四川清风藤0.0036±0.00270.0061±0.00330.0015±0.0012云南清风藤0.0033±0.00270.0060±0.00340.0015±0.00100.0009±0.0009平伐清风藤0.0054±0.00370.0040±0.00280.0087±0.00450.0088±0.00470.0000灰背清风藤0.0054±0.00380.0041±0.00280.0088±0.00460.0089±0.00480.00000.0000鄂西清风藤0.0027±0.00260.0053±0.00330.0010±0.00080.0006±0.00060.0081±0.00460.0082±0.00470.0000簇花清风藤0.0031±0.00230.0037±0.02100.0059±0.00220.0062±0.00330.0056±0.00610.0091±0.00450.0102±0.00720.0002±0.0001阿里山清风藤0.0053±0.00370.0080±0.00420.0036±0.00270.0033±0.00270.0107±0.00520.0109±0.00530.0026±0.00250.0056±0.0011

3.3 候选序列的鉴定效率分析

共有样本两两序列之间遗传距离的Wilcoxon秩和检验结果(表7)表明，3条序列种间变异较明显，均具有统计学意义，种间鉴定效率顺序为：psbK-psbI

3.4 不同序列barcoding gap分析

结果显示，3条序列均未形成明显的“barcoding gap”，psbA-trnH虽然种间、种内遗传距离值存在一定差异，但二者遗传距离混在一起，没有形成明显的间隔，难以区分。matK和psbK-psbI序列的种间、种内遗传距离值均较小，barcoding gap均集中于0.015以下，未形成barcoding gap，详见图1。

表7 两两序列种间差异Wilcoxon秩和检验

W+W-Relative Rank,N.PvalueResultmatKpsbK-psbIW+=1442,W-=1103,n=2656,p≤0matK>psbK-psbImatKpsbA-trnHW+=227,W-=2512,n=2839,p≤0matK

图1 3条序列barcoding gap图

3.5 系统发育树构建

3条候选序列在清风藤属植物的邻接树构建结果显示，matK序列将小花清风藤、簇花清风藤、尖叶清风藤3种分别以85%、91%、66%的自展支持率，各自聚成一支，其余6种未能得到较好区分，灰背清风藤和平伐清风藤聚在一起，云南清风藤和四川清风藤以及鄂西清风藤独立散列一支(图2 A)。psbK-psbI序列小花清风藤散列在大支的一端；灰背清风藤和平伐清风藤聚在一支，尖叶清风藤和簇花清风藤聚在一支，云南清风藤4个样品能聚在一支自展支持率为63%，其他清风藤属物种独立散列在另外一支上，没有很好区分(图2 B)。psbA-trnH序列小花清风藤没有聚为一支，簇花清风藤以98%的自展支持率聚在尖叶清风藤的小支上，灰背清风藤和平伐清风藤聚在一起，其他清风藤属物种聚在一支上，未能区分开(图2 C)。从3条序列的系统发育树聚类结果看，matK序列能够区分部分物种，而psbK-psbI和psbA-trnH聚类结果不理想(图2)。

注：A为matK；B为psbK-psbI；C为psbA-trnH；Bootstrap 1 000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%。

4 讨 论

本研究选取3条叶绿体基因序列对清风藤属植物进行DNA条形码测序分析。结果显示，扩增成功率均为100%，psbA-trnH、psbK-psbI序列测序成功率均到达100%，matK测序成功率较低，88.10%，显示3条序列在清风藤属植物中的通用性较好。3个叶绿体基因序列中，matK序列最长，psbA-trnH序列GC含量最低，但变异位点数量与信息位点数最多。清风藤属植物遗传距离分析结果显示，种间变异顺序为：psbA-trnH>matK>psbK-psbI；种内变异大小顺序为：psbA-trnH>psbK-psbI>matK。仅有psbA-trnH序列种内最大变异小于种间最小变异。从3条序列的NJ树聚类结果看，3条序列均能够区分部分物种，matK各种间的聚类结果较好。

综上，psbA-trnH、psbK-psbI、matK序列在清风藤属植物中种内遗传变异较大，2种间分化程度较低，变异位点仍然不足，在大部分物种中的鉴别能力较弱，不能实现有效鉴定。因此，均不适合单独作为清风藤属植物的DNA条形码序列。在后续的研究中，建议将matK作为清风藤属植物DNA条形码辅助序列，结合ITS、ITS 2等核基因序列，多序列联合分析，进一步对清风藤属植物的分类鉴定与系统演化进行探讨，为清风藤属系统分类、种质资源的保护与可持续开发利用提供更为科学合理的理论依据和参考。