固定化乳糖酶在低乳糖乳制品中的应用

文/景文娟 刘晓兰

（黑龙江齐齐哈尔大学食品与生物工程学院）

牛乳是人们从大自然中获得的“最完美的天然食物”[1]，然而乳糖不耐症这一世界性问题已经成为制约乳制品消费增长的重要因素[2，3]，中国成人乳糖不耐症的比例为75.00%～92.00%[3～5]。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23）能够水解牛奶中的乳糖，生成D-葡萄糖、D-半乳糖、低聚半乳糖[6]。通过乳糖酶水解技术，研究、开发和生产低乳糖含量的乳制品，对解决现阶段乳糖不耐症问题，增加人均乳制品摄入量具有深远意义。

经调查，部分乳品企业通过在牛乳中直接添加乳糖酶的方式生产低乳糖乳制品，该方法存在乳糖酶无法回收，反应时间无法控制，乳糖酶用量大、生产成本高等缺点[7，8]，而乳糖酶的固定化有望解决上述问题。固定化酶技术从1957年发展至今，已应用的固定化载体主要有海藻酸钠[9～13]、树脂[14～16]、壳聚糖[17～19]、纤维素[20～22]、磁性高分子微球[23]等。通过壳聚糖将乳糖酶固定化，测定最适反应条件、稳定性及重复利用次数；通过响应面法优化总结制备低乳糖乳制品的最适水解条件；通过对添加辅料的低乳糖乳制品进行感官评价，解决牛乳脱乳糖后的口感问题。进而为规模化生产受大众欢迎、口感佳、营养丰富的低乳糖乳制品提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

生鲜乳由黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司提供；β-半乳糖苷酶为Sigma产品；壳聚糖为上海生工生物有限公司；邻硝基苯-β-D吡喃半乳糖（ONPG）为上海宝曼生物科技股份有限公司产品；戊二醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和无水碳酸钠为天津科密欧试剂公司产品；其他试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 主要设备

水浴恒温振荡器（SHZ-82）为江苏金怡仪器科技有限公司产品；酸度计（FE20）为梅特勒-托利多仪器有限公司产品；高效液相色谱仪（HPLC 1260）、紫外分光光度计（Cary 50）为美国安捷伦公司产品；干燥箱（DHP-9272）为上海一恒科学仪器有限公司产品。

表1 RSA水解乳糖试验因素与水平表

1.3 试验方法

1.3.1 乳糖酶的固定化

用注射器将2.00%乙酸配制的壳聚糖溶液1∶20（m/V）滴入1.0 mol/L氢氧化钠溶液中，壳聚糖凝聚成白色微球后静置1 h，过滤壳聚糖微球，用蒸馏水洗涤至中性，加入到2.00%的戊二醛溶液中，在30.00℃下恒温水浴摇床摇动交联3 h，用蒸馏水洗去多余的戊二醛。

称取2.5 g壳聚糖微球，加入到10.0 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH值6.5）中，添加15 mg β-半乳糖苷酶，10.00 ℃下180 r/min震荡吸附16 h。滤出微球，用蒸馏水洗至中性，置于0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，4.00℃储存备用。

1.3.2 固定化乳糖酶的酶学性质及稳定性试验

（1）乳糖酶活力的测定

参照文献[24，25]报道的方法测定，取0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH值6.5） 1.8 mL，加入0.1 mL浓度为0.02 mol/L的邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），分别0.1 g固定化乳糖酶和0.1 mL游离乳糖酶，50.00 ℃水浴10.00 min，加入2.0 mL浓度为1.0 mol/L碳酸钠溶液使反应终止，在400 nm处测定溶液的光密度（Optical Delnsity，OD），计算酶活力。

（2）固定化乳糖酶酶最适反应温度的测定

按照酶活力的测定方法，分别在20.00～90.00 ℃条件下反应，以最适温度下测得的游离乳糖酶活为100.00%，测定不同反应温度下固定化乳糖酶相对酶活力。

（3）固定化乳糖酶最适反应pH值的测定

按照酶活力的测定方法，分别在pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的系列缓冲溶液中反应，以最适pH值下测得的游离乳糖酶活为100.00%，测定相对酶活力。

（4）金属离子对固定化乳糖酶活性的影响

在pH值为6.5、温度50.00 ℃条件下，用磷酸盐缓冲液配制1.0 mmol/L的MgCl2、KCl、CaCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2溶液代替磷酸盐缓冲溶液，测定不同金属离子作用下固定化乳糖酶活力，以磷酸盐缓冲溶液作为对照，比较相对酶活力。

（5）固定化乳糖酶机械操作稳定性及重复利用次数

随机选取大小均匀、颗粒饱满且完整的凝胶球状固定化乳糖酶，按1.00 g/L的添加量加入到pH值约为6.7的生鲜乳中，置于50.00 ℃摇床中200 r/min振荡，每隔3 h将固定化乳糖酶与生鲜乳分离，用蒸馏水冲洗，观察固定化酶凝胶颗粒状态有无破裂。分离出的生鲜乳及时进行沸水浴灭酶10.00 min，用高效液相色谱（HPLC）法测定样品中乳糖含量，计算乳糖水解率。连续重复测定10 次，乳糖水解率大于70.00%的重复次数，即为固定化乳糖酶的重复利用次数。

1.3.3 低乳糖乳制品水解条件响应面试验

在单因素试验的基础上，采用响应面法（RSA）进行试验设计，以水解温度、水解时间、固定化乳糖酶的加酶量为因素，以乳糖水解率为响应值，确定酶解的最佳工艺参数，见表1。

采用HPLC法测定生鲜乳样品中乳糖含量，乳糖水解率计算见公式1。

公式1中，S为乳糖水解率；X1为样品水解前乳糖含量；X2为样品水解后乳糖含量。

1.3.4 低乳糖乳制品配方的确定

椰粉中富含中碳链脂肪酸甘油三酯（MCT），能迅速被人体吸收并快速氧化产生能量；玛卡粉具有提神醒脑、消除疲劳、促进新陈代谢的作用[26]。通过调整椰粉、玛卡粉、乳清蛋白粉、果葡糖浆的比例来改善低乳糖乳制品的口感，由10 位经过感官评鉴培训的人员对样品分别进行评分，评分标准见表2。

表2 感官评价评分标准

2.1 温度对固定化乳糖酶活力的影响

酶是一种蛋白质，温度对酶活性影响较大，温度过高时，酶蛋白变性失活；酶的最适反应温度是酶稳定性与反应速率的综合结果，提高反应速度，节省反应时间，可避免生鲜乳因长时间水解而变质。游离乳糖酶与固定化乳糖酶的最适反应温度如图1所示。

试验结果显示，随着反应温度的增加，相对酶活力呈现先上升后下降的趋势。游离乳糖酶的最适反应温度为40.00 ℃，乳糖酶固定化后在50.00～70.00 ℃活性稳定，最适反应温度较游离酶有所升高，这是由于壳聚糖能够提供更好的保护作用，提高了酶的热稳定性，固定化载体使其在更高的温度下仍能具有较高的酶活力。

图1 温度对固定化乳糖酶活力的影响

2 结果与讨论

2.2 pH值对固定化乳糖酶活力的影响

酶的催化能力对外部环境非常敏感，在强酸性或强碱性条件下会导致蛋白质失活变性。在制备低乳糖乳制品过程中，由于生鲜乳pH值约为6.7，因此，研究固定化乳糖酶在此pH值范围内的稳定性尤为重要。游离乳糖酶及固定化乳糖酶的最适pH值如图2所示。

试验结果显示，游离乳糖酶和固定化乳糖酶的活力趋势基本一致，游离酶最适反应pH值为5.0，固定化乳糖酶在pH值为4.5时活力最高，这是因为当酶被结合到多聚阳离子载体上时，载体上带正电荷的基团使载体表面H+浓度比外部溶液中H+浓度低，pH值高于外部溶液，使外部溶液中的pH值向酸性偏移。固定化酶在pH值为6.7左右时，仍保持80.00%以上酶活力。由此可看出，乳糖酶经固定化后在生鲜乳pH值范围内活力稳定，适用于低乳糖乳制品的制备。

2.3 金属离子对固定化乳糖酶活力的影响

生鲜乳中含有较多的钙、铁、锌、镁等金属离子，这些金属离子会对固定化乳糖酶的活力产生影响。试验中，选用MgCl2、CaCl2、KCl等溶液代替磷酸盐缓冲液，测定不同金属离子作用下固定化乳糖酶的活力，与磷酸盐溶液进行比较，相对酶活力如图3所示。

由图3可以看出，M g2+、Fe2+、Zn2+对固定化乳糖酶激活作用明显；Ca2+、K+对固定化乳糖酶活性影响作用不大；Cu2+对固定化乳糖酶活力起抑制作用，可能由于Cu2+与酶蛋白侧链残基结合而导致酶失活。生鲜乳中Cu2+的含量仅为0.02 mg/100 g，对固定化酶的抑制作用可忽略不计。

图2 pH值对固定化乳糖酶活力的影响

图3 金属离子对固定化乳糖酶活性的影响

表3 固定化乳糖酶机械操作稳定性

2.4 固定化乳糖酶的稳定性

用固定化乳糖酶经过10 次反复试验制备低乳糖乳制品，每次试验结束后及时观察凝胶颗粒形态，测定乳糖水解率，固定化酶重复利用次数与乳糖水解率的关系见表3。

随着重复利用数的增加，凝胶颗粒无破碎开裂现象，乳糖水解率逐渐下降；当利用固定化乳糖酶酶解试验重复9 次后，乳糖水解率下降到70.00%以下，从而得出固定化乳糖酶重复利用次数为8 次。提高固定化酶的重复利用次数，有利于节约成本。

2.5 低乳糖乳制品水解条件的优化

表4 RSA试验结果

图4 各因素对乳糖水解率的响应面图

乳糖水解率是衡量乳糖水解程度的重要指标，采用HPLC法对乳糖含量进行测定。以反应温度、反应时间、固定化的酶添加量为因素，乳糖水解率为响应值，进行低乳糖乳制品条件试验，RSA试验结果见表4。

通过Design Expert.V8.0.6.1软件得到：水解率=79.50+7.74A+1.91B+9.55C+0.75 AB+2.44AC+0.035BC-9.67A2-17.12B2-9.35C2。对该模型进行回归方差分析，见表5。

由表5可知，模型是显著，失拟项不显著，且R2是0.9940，是0.9864，该模型与试验结果良好拟合。通过响应面曲线图（图4）可进一步研究相关变量之间的交互作用并确定最优点。

由图4（a）可见，当固定化乳糖酶的添加量为1.00 g/L时，相同温度，乳糖水解率随时间的延长而增加；相同水解时间，水解率随着温度的增加呈抛物线变化。当固定化乳糖酶的添加量为1.00 g/L，水解温度为50.32 ℃，水解时间为191.54 min时，乳糖水解率最高可达80.99%。

图4（b）表明，水解温度为50.00 ℃时，水解时间相同，乳糖水解率随固定化乳糖酶的添加量增加而增加；酶的添加量一致时，水解时间与乳糖水解率呈正相关。当加酶量为1.28 g/L，水解时间为193.62 min时，乳糖水解率最高可达83.90%。

图4（c）表明，水解时间为180.00 min的条件下，水解温度一定，随着加酶量的增加，乳糖水解率随之增加；同一加酶量，乳糖水解率与反应温度呈抛物线趋势，由于温度过高，导致酶的相对失活。当反应温度为50.28 ℃，固定化酶添加量为1.28 g/L时，乳糖水解率预测值为81.99 %。

通过软件对试验得到的数据进行优化，得出制备低乳糖牛奶的最佳水解条件：反应温度50.33 ℃，反应时间181.99 min，加酶量1.28 g/L，软件估测乳糖水解率最高为83.98%。按该组合进行3 次验证试验，制得的低乳糖乳制品水解率均值为（82.79±1.31）%，与软件估测结果能良好吻合。

表5 回归方程方差分析

表6 L9（34）低乳糖牛奶饮品配方正交试验因素水平

2.6 低乳糖乳制品添加剂配方的确定

以玛卡粉、椰粉、乳清蛋白粉、果葡糖浆4种原料，设计L9（34）正交试验，通过感官评价得分的方式，确定产品的最佳配方见表6。

通过10 位感官评鉴人员对产品色泽、组织状态、气味和口感分别进行评分，分数总和为总得分，平均值的整数为该产品得分，感官评分结果见表7。

由表7中的极差值可以看出，4 个因子对感官评价结果的影响作用由大到小依次为玛卡粉、乳清蛋白粉、椰粉、果葡糖浆。在试验水平范围内，打分最高的组合是A2B2C3D1，即最佳添加剂配方为：玛卡粉0.08%、椰粉3.00%、乳清蛋白粉1.80%和果葡糖浆2.00%。通过3 次平行验证试验，平均值为88 分，配制的低乳糖乳制品呈淡黄色，甜度适宜，具有椰子清香味，爽滑适口，因此选择A2B2C3D1配料组合为最佳配方。

表7 低乳糖牛奶饮品配方正交试验结果

3 结论

壳聚糖固定化的乳糖酶在50.00～70.00 ℃活性稳定，酶的最适反应温度较游离酶有所升高；在生鲜乳固有pH值范围内保持80.00%以上酶活力。制备低乳糖乳制品的最佳反应条件为50.33 ℃、181.99 min、固定化乳糖酶添加量1.28 g/L，该条件下制备的低乳糖乳制品，乳糖水解率为83.98%。水解乳糖过程中微球颗粒无破损现象，稳定性好，可重复使用8 次，极大的提高了酶的利用率，降低了生产成本和管理费用。通过调节玛卡粉、椰粉、乳清蛋白粉、果葡糖浆的配比，制备出了气味清香，甜度适宜、营养丰富、受消费者欢迎的低乳糖乳制品。为固定化酶工业化生产低乳糖乳制品奠定基础。C