脉冲场凝胶电泳对不同牛舍中大肠杆菌的分析鉴定

文/李庆雷 王金新 刘 鹏 付 嵩 马 驰

（山东高速生物工程有限公司）

2020年初，一场史无前例的新冠肺炎疫情严重影响了全球，公共生物卫生安全引起重大关注，未来，生物安全极有可能越来越频繁地威胁人类公共卫生安全。生物安全防控过程中，最难控制的传播途径就是病原微生物的气溶胶传播，尤其是导致人畜共患病的病原菌传播控制难度大，危害性强。

现代集约化奶牛场中，奶牛粪便中的微生物扩散到空气中，形成微生物气溶胶，具有浓度高、分布广、扩散快的特征，能导致气源性传染病的传播，严重威胁工作人员健康、奶牛生产性能及健康[1]，甚至导致某些传染病的暴发流行。在奶牛养殖生产中，大肠杆菌引起的奶牛疾病较常见[2]，奶牛乳房炎和犊牛腹泻等疾病都与大肠杆菌感染密切相关[3]，对牧场造成了极大的经济损失，且大肠杆菌还是人畜共患病原菌，因此，对大肠杆菌气溶胶传播方式的研究非常重要。

本文分别在泌乳牛舍、青年牛舍和犊牛舍收集空气样品，进行分离培养，利用脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）[4]技术对采集到的大肠杆菌进行同源性分析[5]，探讨大肠杆菌的来源，分析奶牛舍之间大肠杆菌气溶胶的传播方式。

1 材料和方法

1.1 空气样品采集

2019年10月，从山东济南某现代化奶牛场采集样品，该奶牛场有8 栋开放式牛舍。开放式奶牛舍长110.0 m，宽27.0 m，高6.0 m，舍内温度为15～23 ℃，湿度为48%～57%，每日机械清理粪便5次，舍外温度为15～23 ℃，湿度为46%～54%，风速为0。分别对其中1 栋泌乳牛舍（饲养奶牛240 头）、1 栋发育牛舍（饲养6～14 月龄奶牛280 头）和1 栋犊牛舍（饲养3～6月龄奶牛320 头）采集空气样品。

1.2 气载大肠杆菌的收集

采用Andersen-6级[6]空气微生物样品收集器，气流速度28.3 L/min，设置于奶牛舍中央，采样时间5 min，重复采样5 次。

1.3 粪便中大肠杆菌的分离与鉴定

无菌收集新鲜的粪便样本每舍15 个，取1 g粪便，放入盛有9 mL灭菌生理盐水中稀释，后接种到麦康凯3号培养基，37 ℃过夜培养[7]，再从每个平板中挑取典型红色菌落[8]，选用麦康凯3号培养基为采样介质[9]，样本在37 ℃条件下培养48 h后，然后用API 20 E（Bio Merieux，Marcy-I，Etoile，France）鉴定大肠杆菌，最后将其放入含30%甘油的肉汤培养物中，-20 ℃保存[10]。

图1 PFGE鉴定图

1.4 对不同来源大肠杆菌进行PFGE分型

参照美国CDC PulseNet USA对大肠杆菌分型的方法进行脉冲场凝胶电泳[11]。首先制成细菌包埋块，在54 ℃条件下细胞裂解2 h后，在37 ℃ XbaI酶切2 h，使用CHEF Mapper电泳仪，在1%SeaKem Gold Agarose（Lonza Rockland，ME USA）（Pharmacia Biotech）上跑电泳。电泳条件为温度14 ℃，角度120°，脉冲时间5～60 s，电压6 V/cm，电泳时间18 h[12]。电泳结束后，用紫外成像系统（Tanon-2500）拍照并保存。

图2 大肠杆菌PFGE分析图

2 结果

2.1 PFGE 电泳图片

在采集的空气样品和粪便样品中总计分离到9 株大肠杆菌，经过PFGE电泳后，紫外凝胶成像仪上记录下的PFGE凝胶图片见图1。

2.2 PFGE 结果判定

对于图1，利用计算机分析软件（Tanon-2500）记录下扩增及电泳谱带。每个样品的扩增带存在时，赋值为“1”；不存在时，赋值为“0”，用电泳图象分析软件（Gel Image System，Version 4.00）进行分析后自动生成矩阵图。运用非加权对数算术平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），采用NTSYS-pc 2.10[13]软件构建聚类树状图（图2）。

由于细菌存在合理的变异性，判断不同来源的菌株是否为同一菌株时允许有一定的变异存在。Tenover等[14]提出了有关菌株同源性的判别标准，按其电泳条带可分为：无差异， 说明为相同菌株；有1～3 条带的差异说明菌株间有相近关系，且只有单基因的改变；4～6 条带的差异说明菌株间可能有相近关系，表示出有2 个独立基因的差异；如菌株间有6 条带或更多条带差异，说明有3 个或更多基因的变化，被视为无相关性。该标准只适合于小量的局部性基因的变化研究，有一定的局限性。Tenover等在解释PFGE结果时提出将具有85%以上相同条带的菌株认为是相同的菌株，50%以上的条带不相同时，菌株被认为流行病学不相关。

从图1可以看出，有6 株菌株同源性高于85%，据此判定具有同源性，说明大肠杆菌可以从粪便中传播到空气中，进而在牛舍之间传播。

3 讨论

3.1 空气微生物采样方法

采用国际通用的微生物气溶胶收集器，ANDERSEN-6级收集器收集空气中的微生物气溶胶，可采集到的粒谱范围在0.2～20.0 m，采集到的活粒子数多，敏感性高，是一种非常准确、有效的气载微生物采样方法。

3.2 同源性分析方法

以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）为基础的分子生物学分型技术，在微生物同源性分析上被应用，比如随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、细菌基因组重复序列PCR技术（Rep-PCR）、肠杆菌基因间重复共有序列PCR技术（Eric-PCR）、多重PCR技术（Multiplex-PCR）等，省时、省力、简单、快速且成本低，且对实验操作和仪器试剂要求不高，因此，被广泛应用到多种细菌的分型中。然而这些方法的分辨率以及重复性很难区分遗传关系相近的菌株[10，15～17]。近几年，PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”[18～20]，在分型上的应用越来越广泛。Moissenet（1996）[18]、Stewart（1995）[19]等均已证实PFGE的分辨率和重复性远远高于ERIC-PCR等以PCR为基础的分子生物学分型技术，是鉴定病原微生物气源性传播的较理想技术。鉴于此，对不同来源的菌株进行PFGE分型，比较其遗传相似性，认知细菌的来源，从根本上确认奶牛舍之间微生物气溶胶传播方式。

4 小结

大肠杆菌在奶牛舍及其周围环境中是一种常见菌。Hojovec等（1977）[8]曾将大肠杆菌作为评估畜禽舍空气质量的指示细菌。运用PFGE分型方法，通过比较泌乳牛粪便和不同牛群舍内气载大肠杆菌的同源性发现，从泌乳牛的粪便中分离的大肠杆菌与泌乳牛舍和小牛舍空气中分离到的大肠杆菌有2 株（占总数量23%）相似性可达85%以上，因此，推测奶牛粪便中的大肠杆菌可以形成气溶胶污染奶牛舍空气。但是，某些从舍内空气中分离到的大肠杆菌与粪便中的相似性较小，出现这种结果一方面，可能是舍内分离到的大肠杆菌确实不是来源于粪便；另一方面，采集的粪便样本有限，没有分离到与空气中同源的大肠杆菌；或者是这些大肠杆菌来源于其他方面，如饲料、垫料或饮水等。

结果表明，从泌乳牛的粪便中分离的大肠杆菌能够对环境造成生物污染，在泌乳牛舍中形成环境微生物气溶胶，并随空气传播，对奶牛环境性疾病的防控及环境消毒具有理论指导作用，并具有公共卫生学意义。