马铃薯V型ATP酶E亚基基因的生物信息学分析

庞鹏湘，郜 刚

（山西师范大学生命科学学院，山西 临汾 041000）

V 型ATP 酶（V-type ATPase，以下简称V-ATP酶）主要存在于真核生物膜系统中，通过将氢离子转运到囊泡或胞外，酸化细胞环境，以溶酶体和高尔基体2 种细胞器参与其内吞途径[1]，其利用ATP 水解的能量转化为电化学势能，进而介导氢离子的跨膜转运[2]。该酶在植物中的研究以拟南芥居多。在拟南芥中，至少有26 个基因编码了全酶的12 个亚基[3]。研究发现该酶在拟南芥不同的部位所行使的功能具有很大的差异。如：V-ATP 酶C1 亚基在膨大的子叶、黄化幼苗下胚轴、根伸长区中的表达，支持了V-ATP 酶在细胞体积增大中的作用；在根冠，V-ATP 酶影响根系的生长以及对中度盐胁迫的耐受性[4]。同时研究发现ATP 酶B亚基可能参与拟南芥花粉萌发、花粉管生长、细胞内物质流动和细胞应急胁迫、质子传递等生殖生物学过程[5]。在对蝴蝶兰的研究中发现V-ATP酶E亚基在抵抗低温胁迫中有重要作用。

在拟南芥中，V-ATP酶E亚基有3个亚型，各亚型间在功能上具有不同程度的特化，其中AtVHA-E1 是胚胎发育表达的主要亚型，而AtVHA-E2是花粉特异表达亚型，在配子体发育中具有专一性但又不是必需的，主要在发育种子的胚乳及周围组织中表达的是AtVHA-E3亚基。对突变体研究表明，AtVHA-E3 能够恢复AtVHA-El 缺失的表型，而AtVHA-E2却不能。

目前，没有太多的V-ATP 酶在马铃薯中的表达、功能等相关研究。有文章报道，在马铃薯中克隆一个V-ATP酶，使用对照和150 mmoL NaCl耐受性愈伤组织系的Tonoplast 富集囊泡作为模型系统来研究其活性以及参与液泡作为马铃薯耐盐机制。结果发现液泡膜上的pH 梯度和Na+/H+反向物质对盐的响应增加强烈，使得Na+隔离到液泡，在这个过程中V-ATP 酶发挥一定的催化作用，推论该酶有助于马铃薯耐盐性的表现[4]。

利用分子生物学公用数据库，对基因的分子生物学特性、生化特性进行分析，预测其蛋白质的结构。本研究以马铃薯幼苗为材料，克隆了V型ATP 酶E 亚基基因的全长，并对其序列进行分析，为下一步验证马铃薯V-ATP 酶E 亚基基因的功能及在青枯菌胁迫中的分子调控机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 V型ATP酶E亚基基因的电子克隆

将实验室前期工作中获得的一条受青枯菌诱导上调表达的马铃薯（基因型为ED13）的EST序列，在NCBI 中运行BLASTn 程序[6]。作为Query 的EST 与NCBI 数据库中XM006352196.2 基因相似最高为98%。通过Bioedit软件将序列拼接，直到不能延伸为止。

1.2 V型ATP酶E亚基基因编码蛋白质的生物信息学分析

用在线服务器NCBI ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析核酸序列的开放阅读框。通过NCBI Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测相关的V-ATP酶的保守结构域；运用ProtParam（http://www.expasy.org/cgi-bin/ProtParam.pl）和ProScale（http://www.expasy.org/cgi-bin/Protscale.pl）[7]进行分析蛋白的分子量（Molecular weight）、等电点（Theoretical pI）、亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity，GRAVY）、不稳定指数（Instability index）和脂溶指数（Aliphatic index）。CBS服务器的SignalP4.1 server 系统（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用来分析信号肽[8]。利用WOLF（PSORThttps:/ /wolfpsort.hgc.jp/）和TargetP2.0 Serverr（http ://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/）分析蛋白质的亚细胞定位[9]。TMHMM Server 分析蛋白质的跨膜区域[10]。NetPhos 2.0 Server（http:// www. cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质磷酸化位点。PSIPRED analysis（http://bioin f.cs.ucl.ac.uk/psipr ed/）进行蛋白质二级结构预测[11]，SWISS models（https://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三级结构预测[12]。

1.3 V型ATP酶E亚基基因序列的进化分析

进入NCBI，输入目标基因的氨基酸序列，点击BLAST进行同源性分析，按照相似度由高到底的顺序，选择一定条数的序列依次下载，并使用MEGA 5.0软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）用来构建系统树，来进行进化地位分析[8]。

2 结果与分析

2.1 V型ATP酶E亚基基因序列

马铃薯V型ATP酶E亚基序列通过电子克隆获得了一条碱基个数为1 257 的序列（图1），通过ORF Finder分析核酸序列的开放阅读框，得到这条序列的开放阅读框碱基个数为726（126～852），以ATG为起始密码子，以TAG为终止密码子，编码的蛋白质个数为241。NCBI Conserved domains保守结构域的预测，得到一个保守结构域vATP-synt_E，该家族包括液泡ATP合成酶E亚基以及古细菌ATP合成酶E亚基。

2.2 V型ATP酶E亚基基因编码蛋白质的生物信息学分析

每种氨基酸都有特定的理化性质，而整个蛋白质的性质则往往是其组成氨基酸性质的加和。V型ATP酶E亚基蛋白在马铃薯基因组中blastp，有4条目标基因，这4个基因染色体位置尚不明确，运用ProtParam和ProScal进行分析V型ATP酶E亚基蛋白理化性质分析，蛋白的分子量（Molecular weight）是27 689.84 D、等电点（Theoretical pI）是7.28、不稳定指数（Instability index）是44.06，该数值高于阈值40，为不稳定蛋白，V型ATP酶E亚基蛋白属于不稳定蛋白、半衰期在哺乳动物的网织红细胞中为30 h，在酵母细胞中大于20 h，在大肠杆菌体内大于10 h、脂溶指数是增加球形蛋白热稳定性的一个积极因素，该蛋白的脂溶指数（Aliphatic index）是95.06、正电荷残基数（Arg + Lys）和负电荷残基数（Asp+Glu）各是38个。蛋白质的种类、空间结构及活性、功能都与肽链中氨基酸的种类及顺序有关（表1），该蛋白由20种氨基酸组成，其中Glu（E）含量最高，为11.2%，其次Lys（K）、Leu（L），占9.1%；Thr（T）和Trp（W）含量最低，分别为0.8%、0.4%，亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.551，该数值为负值则说明该蛋白为亲水性蛋白，在整个肽链当中呈极不均匀分布（图2）；疏水性氨基酸很明显的少于亲水性的氨基酸，并且亲水性在第50～100个氨基酸区间较高；疏水性在第100～150个氨基酸区间比较高，所以V型ATP酶E亚基蛋白属于亲水性蛋白。

信号肽主要由疏水性氨基酸组成，运用SignalP4.1 server进行信号肽分析，预测结果为，该序列不存在信号肽，这与马铃薯V-ATP酶E亚基蛋白这一膜蛋白性质相符合。基因编码的蛋白质在细胞中的分布与该蛋白的功能紧密相关，从而在一定程度上反映了该基因的功能。利用WOLF 和TargetP2.0 Serverr 分析蛋白质的亚细胞定位，该蛋白细胞质可能在细胞质（Cyto）、叶绿体（Chlo）、细胞核（Nucl）、线粒体（Mito）和过氧化物酶体（Pero）中，主要分布在细胞质和叶绿体中。蛋白质序列含有跨膜区，可能作为膜受体起作用，也可能是定位与膜的锚定蛋白。将蛋白质序列在TMHMM Serverv 2.0中检索，预测其无跨膜区。NetPhos 2.0 Server进行磷酸化位点的预测，其结果显示，该氨基酸序列共10个磷酸化位点，8个Ser、1个Thr和1个Tyr。

了解蛋白质的空间结构不仅有利于认识蛋白质的功能，也有利于认识蛋白是如何执行其功能的。SWISS model预测得到蛋白质三级结构（图3），利用SWISS model预测的蛋白质三级结构与模板之间的序列同源性为32.09%（V-typeproton ATPase subunit E，SMTL ID：3j9t.1P）。该蛋白质的三级结构有α螺旋、延伸链、β转角和不规则卷曲4种形式。其中最主要的二级结构是α螺旋，共由168个氨基酸参与形成4段α螺旋区域，占全部氨基酸的69.71%；19个氨基酸参与形成延伸链，占全部氨基酸的7.88%；β转角由9个氨基酸形成，占全部氨基酸的3.73%；45个氨基酸形成不规则卷曲，占比为18.67%。

表1 V型ATP酶E亚基蛋白的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of V-type ATPase E subunit protein

2.3 V型ATP酶E亚基基因系统进化分析

通过系统进化树，可以研究生物进化和系统发育过程，概括各种生物之间的亲缘关系。运行MEGA 5.0软件，将与该序列匹配度较高的20条序列输入，构建进化树（图4）。从图4中可以看出，马铃薯V-ATP 酶E 亚基与马铃薯E 亚基属于同一分支，与烟草、烟草变种和潘那利番茄V-ATP酶E亚基的同源性也相对较高，而与木薯、巴西橡胶树、蓖麻、可可、榴莲属、米莎草（芭蕉亚种）、莲属、金鱼草等同源性较远。

3 讨 论

从马铃薯中克隆了V-ATP酶E亚基基因的全长序列，并对其进行了生物信息学分析，结果表明，该序列没有信号肽，具有多种功能保守域，编码的蛋白质为一亲水性蛋白，具有水解酶活性，研究结果与其他生物V-ATPase E亚基的特征一致。

V-ATP酶在细胞内参与多种生化反应，例如含有与肌动蛋白结合和位点，参与细胞骨架的形成以及细胞的运动；具有调节hsp70活性的结构域，预测具有调节蛋白质的折叠、多肽在细胞器膜上的易位、协调对压力的反应，以及特定的蛋白质降解有关；多种酶的催化活性，参与细胞的生长，细胞内酸化的主要调节剂、参与物质的转运[13,14]、参与到多种信号传导的过程[15]，涉及多种胁迫生理调控[16,17]，过表达V-ATPase E 亚基的转基因拟南芥植物增强了对盐和甘露醇耐受性[18]。其作用机制有待于进一步研究。显然，试验结果为进一步研究V-ATPase E 亚基基因功能及在青枯菌胁迫下的响应机制提供了依据。

V 型ATP 酶E 亚基蛋白位于KEGG 中，V-ATP 酶E 亚基参与的途径分类范围属于生物特异性生物系统，包括吞噬、氧化磷酸化和代谢途径。吞噬作用是通过细胞摄取相对大颗粒的过程，并且是组织重塑，炎症和防御感染因子的中心机制。当吞噬细胞表面上的特异性受体识别颗粒表面上的配体时，形成吞噬体。形成后，新生的吞噬体逐渐获得消化特征。吞噬体的这种成熟涉及与其他膜细胞器的调节相互作用，包括再循环内体，晚期内体和溶酶体。吞噬体和溶酶体融合释放出有毒产物，杀死大多数细菌并将其降解成碎片。表明V-ATPase E 亚基基因可能响应青枯菌胁迫。

V-ATP 酶的分布广泛且结构复杂，对细胞的生理功能有着重要作用，研究表明V-ATP 酶的表达及相应的调控有多种方式。V-ATP 酶的功能调控方式包括V1 和V02 个结构域的解离和结合，内部巯基的可逆氧化，激活剂和抑制剂的影响，靶标膜的选择几个方面。V-ATP 酶的表达调控方式包括转录水平的调控和转录后水平的调控。其中，翻译后修饰（PTM）是调节基因表达的关键水平之一，其决定了真核细胞翻译后蛋白质的命运，对疾病的诊断和预防有用，真核V-ATP 酶E功能可以通过催化V1 区和膜嵌入的V0 区的可逆解离来调节，具体的调控机制有待进一步研究。