他克莫司对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的修复作用

陈财铭 李艺虾 林佳群 万建新

350005 福州，福建医科大学附属第一医院肾内科

肾小球滤过屏障由内皮细胞、肾小球基底膜和脏层上皮细胞(足细胞)组成，其中足细胞的作用至关重要。有研究表明蛋白尿与足细胞受损密切相关[1]。本文建立以足细胞损伤为主的阿霉素肾病模型，用新型免疫抑制剂他克莫司进行干预处理，探讨他克莫司对足细胞损伤的修复作用，从而为足细胞病治疗提供新的实验依据。

材料和方法

一、实验动物与试剂

清洁级雄性SD大鼠，2月龄，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，喂养于福建医科大学实验动物中心SPF级环境。阿霉素(深圳万乐药业)，他克莫司(安斯泰来制药有限公司)，TUNEL试剂盒(罗氏公司)，兔抗WT-1多克隆一抗(Abcam公司)，兔抗nephrin多克隆一抗(Abcam公司)，兔抗p38多克隆一抗(Santa cruz公司)，兔抗caspase-3多克隆一抗(Merk Millipore公司)，山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥公司)，山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥公司)，Alexa Fluor594标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。

二、方法

1.分组 健康雄性SD大鼠，标准饲料喂养，自由进食和饮水，普通光照，适应性饲养2周。将24只SD大鼠随机分成3组(每组各8只)。对照组：不进行阿霉素尾静脉注射，也不给予他克莫司灌胃处理，仅以等量生理盐水尾静脉注射和灌胃；模型组：于实验第1天尾静脉注射阿霉素4 mg/kg，间隔1周，即第7天给予第二次尾静脉注射阿霉素3.5 mg/kg，并以等量生理盐水灌胃；他克莫司组：与模型组相同的方法进行阿霉素尾静脉注射，并在第一次尾静脉注射阿霉素后同日给予他克莫司进行灌胃，剂量为0.5 mg·kg-1·d-1。

2.标本收集 尿液收集：将大鼠置于代谢笼中，给予标准饲料，自由饮水，后分别于实验第0、7、14、21、28、35天通过代谢笼收集大鼠24 h尿液，加入防腐剂后保存于-80℃待统一送检。

肾脏标本收集：于造模第35天收集肾脏标本。大鼠麻醉后，打开腹腔迅速切开肾脏包膜，取出双侧肾脏，沿纵轴剖开，左侧肾组织以10的福尔马林固定并编号，石蜡包埋，超薄切片机3 μm连续切片，常规做HE染色。同时，用锋利的刀片切取1 mm肾皮质组织，立即投入电镜固定液中。右侧肾脏沿纵轴剖开后放入-80℃冰箱中保存，供后续Western-blot法检测。

3.大鼠24小时尿蛋白定量检测 24只大鼠饲养于代谢笼中，于造模前一天及造模第7、14、21、28、35天收集大鼠24 h尿液，加入防腐剂，置于-80℃冰箱保存，待造模结束后(第35天)收集完毕统一送检，采用我院全自动生化分析仪检测大鼠24 h尿蛋白排泄量。

采用TUNEL法测足细胞凋亡。石蜡切片按常规方法脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液37℃反应15～30 min，进行标记反应1 h(37℃)，加converter-POD转化液37℃孵育30 min，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片观察。以肾小球内出现棕黄色颗粒为阳性结果，以PBS代替一抗作阴性对照。采用图像分析软件Image-Pro Plus6.0对各组阳性结果进行积分光密度值分析。

5.免疫印迹检测 取肾脏皮质组织约50 mg在裂解液1 mL中匀浆，加入等体积的2×SDS，100℃水浴5 min，离心后取上清。制备10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE积层胶、蛋白上样、电泳、将SDS-PAGE凝胶上分离出的蛋白条带转至PVDF膜，1%丽春红染液预染，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗、二抗孵育，最后加入ALP显影剂显影。胶片条带扫描，用凝胶图像处理系统分析目标蛋白与β-actin的光密度比值，表示目标蛋白的表达水平。

三、统计学处理

表1 他克莫司对阿霉素肾病大鼠尿蛋白的影响(mg/24 h)

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

结 果

一、他克莫司对阿霉素肾病大鼠尿蛋白的影响

造模前一天各组大鼠尿蛋白比较，差异无统计学意义(P>0.05)；造模后第7、14、21、28、35天，模型组和他克莫司组24 h尿蛋白排泄量均明显高于对照组(P<0.05)，但他克莫司组较模型组尿蛋白显著降低(P<0.05)。表明阿霉素尾静脉注射造成大鼠肾脏损伤，引起大量蛋白尿；他克莫司治疗可显著减少大鼠尿蛋白。(表1)

二、他克莫司对阿霉素肾病大鼠肾组织损伤的影响

肾组织HE染色可见，3组大鼠肾小球、肾小管和肾间质未见明显异常。电镜显示模型组肾小球足细胞肥大，胞浆空泡样变性，足突广泛融合、裂隙消失，表明大鼠微小病变型肾病模型造模成功；他克莫司组大鼠足细胞足突融合减轻，突起成指状或栅栏状攀附于肾小球基底膜，表明他克莫司能够改善足细胞足突融合，修复足细胞损伤。(图1)

三、他克莫司对阿霉素肾病大鼠足细胞数量的影响

WT-1是表达于足细胞胞核的细胞特异性蛋白，图2显示WT-1免疫组化染色可将肾小球足细胞胞核染成棕色，模型组较对照组肾小球中棕色染色颗粒明显减少，其积分光密度值明显下降(P<0.05)；他克莫司组肾小球足细胞胞核棕色染色颗粒显著增多，积分光密度值增加(P<0.05)。表明他克莫司治疗可以减少阿霉素肾病大鼠足细胞的丢失。

四、他克莫司对阿霉素肾病大鼠足细胞凋亡的影响

采用TUNEL法检测大鼠肾小球足细胞的凋亡，结果显示模型组肾小球内棕色染色颗粒较对照组明显增加(P<0.05)，提示阿霉素尾静脉注射可诱导足细胞凋亡；他克莫司治疗后，大鼠肾小球内棕色染色颗粒明显减少(P<0.05)，表明他克莫司能够抑制足细胞凋亡。足细胞凋亡蛋白caspase-3免疫荧光染色显示，模型组较对照组caspase-3表达明显增强(P<0.05)；他克莫司治疗后，caspase-3荧光强度明显下降(P<0.05)(图3)。Western blot检测结果同样显示，模型组较对照组caspase-3蛋白表达量明显增多(P<0.05)；他克莫司治疗后，caspase-3蛋白表达量明显减少(P<0.05)(图4)。以上结果均表明阿霉素注射导致足细胞凋亡增加，他克莫司可抑制足细胞凋亡。

讨 论

足细胞是肾小球滤过膜最后一道屏障，其功能受损已被证实是蛋白尿发生的关键环节。以足细胞损伤或功能异常为基础的肾小球疾病又称为足细胞病，包括微小病变性肾病、局灶节段肾小球硬化、弥漫性肾小球系膜硬化、塌陷性肾病[2]。Barisoni等[3]提出足细胞对损伤刺激的反应有4种表现：(1)表型修饰为足突融合但足细胞数目没改变；(2)细胞凋亡伴有足细胞减少；(3)发育停滞伴有轻度增殖活动；(4)分裂并重新进入细胞周期伴有明显的增殖活动。

足细胞通过裂孔隔膜蛋白、顶膜区蛋白、基底膜区蛋白和细胞骨架蛋白稳定附着于肾小球基底膜上。nephrin、podocin、CD2AP等构成裂孔隔膜蛋白，其中以nephrin为关键组分；足细胞顶膜区由带负电荷的蛋白多聚复合物覆盖，形成了肾小球滤过膜的电荷屏障；基底膜区蛋白α3β1整合素使足细胞锚定于肾小球基底膜上；细胞骨架蛋白包括actin、actinin-4和synaptopodin，连接基底膜的整合素和裂孔膜蛋白起到桥梁作用，从而维持足细胞的正常形态功能。这4组分子蛋白中任何一组蛋白受损均会导致足细胞的损伤和丢失，而足细胞丢失将导致肾小球硬化发生和发展。足细胞丢失的百分率与肾小球疾病的严重程度成正相关[1，4]。因此，维持足细胞应有的数量从而维持肾小球正常滤过功能成为近年来的研究热点。

他克莫司是一种新型免疫抑制药物，它能够抑制多种炎症因子如IL-2、IL-10等的产生，抑制T淋巴细胞的功能，发挥强大细胞免疫抑制作用[5-7]。同时，他克莫司也能抑制B细胞功能，抑制体液免疫[8]。他克莫司最早被应用于临床器官移植术后免疫排斥反应的预防和治疗，取得了很好的抗免疫排斥效果。近10多年来，人们尝试将他克莫司联合激素应用于多种激素耐受性肾小球疾病的治疗，获得较满意的治疗效果[9-11]。国内学者的研究发现他克莫司可以通过减少足细胞表达和分泌血管生成素样蛋白4(Angptl 4)，减少足细胞损伤的作用[12]。

微小病变肾病的发病机制尚不十分清楚，目前主要认为与T细胞免疫功能紊乱，介导异常的免疫应答导致足细胞损伤而发病[13]。他克莫司能够穿透细胞膜进入细胞内与他克莫司结合蛋白(FKBP)结合，抑制T淋巴细胞核转录因子，通过抑制T淋巴细胞的活化和增殖，下调细胞免疫应答，进而保护细胞免于损伤[14-16]。

本研究建立阿霉素肾病模型，类似于人类微小病变肾病，单独应用他克莫司进行干预，结果显示干预组大鼠尿蛋白明显减少，足突融合改善和足细胞数目恢复，从而在体内实验证实了单独应用他克莫司对肾小球疾病的治疗同样具有显著的疗效。

近年来的研究发现阿霉素诱导足细胞凋亡通过两个途径。一个是通过激活核转录因子(NF-κB)，上调Fas和caspase-3蛋白的表达来实现[17]，或者刺激线粒体释放细胞色素C，间接刺激caspase-3表达实现[18]；另一个是通过刺激线粒体融合蛋白1和2的表达，改变线粒体的外部形态和内部F-actin骨架蛋白重构来实现[18]。有学者通过对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PAN)诱导大鼠足细胞病模型的研究，发现环孢素A和他克莫司均能够直接下调caspase-3的表达抑制细胞凋亡，还能通过抑制线粒体细胞色素C释放，间接抑制细胞凋亡，并且减轻线粒体功能紊乱而抑制细胞凋亡[19]。Liao等[20]研究他克莫司对狼疮肾炎的足细胞保护时，发现他克莫司可以稳定F-actin骨架蛋白，抑制TGF-β1诱发的细胞凋亡。我们的研究在建立阿霉素肾病大鼠模型后，以他克莫司灌胃干预，与模型组相比，治疗组大鼠尿蛋白显著减少，TUNEL结果显示足细胞凋亡阳性率下降，Western blot结果提示caspase-3蛋白表达量下降，免疫荧光结果提示肾小球caspase-3阳性细胞数减少，从而在体内验证了他克莫司具有抗足细胞凋亡作用，其具体细胞信号通路有待进一步研究。

综上所述，本文初步证实了他克莫司可修复阿霉素肾病大鼠足细胞损伤，其机制与抑制足细胞凋亡有关。