产细菌素乳酸菌的筛选及其发酵牛奶的工艺优化

侍宝路 王梓旭 胡丹丹 王计伟 刘春雪

（安佑生物科技集团股份有限公司，江苏太仓215437）

乳酸菌素由乳酸菌菌体细胞中核糖体合成的对近源微生物具有抑菌活性的蛋白质或者多肽，但产生菌对其具有耐受作用[1]。根据乳酸菌素的化学结构、理化性质和分子特征，可将其分为三大类：羊毛硫细菌素、小分子热稳定多肽和大分子热不稳定蛋白[2]。乳酸菌素类型不同造成抑菌机理不同，总的来说包括细胞壁损伤机制、阻碍细胞分裂和细胞膜损伤机制[3]，由于其广谱抑菌、无毒素残留、无耐药性等特性，被广泛应用于食品、医药和饲料行业中[4]。近年来大量使用抗生素的弊端日益严重，畜牧业产业升级面临巨大挑战，而随着乳酸菌素的广谱抑菌效果不断被发现，其替代抗生素用于预防和治疗动物疾病具有广阔的前景[5-6]。

乳酸菌素在动物生产上的应用可通过体表用药和口服方式来预防和治疗病源感染疾病，以达到促进生长的效果[7-8]。乳酸菌素在饲料中的应用，可改善肉鸡生长性能，提高其抗氧化功能[9]，与抗生素达到相同的效果[10]；可提高犊牛对饲料的消化吸收，增强机体免疫功能，促进生长[11-12]。乳酸菌素产生菌来自发酵食品、动物肠道、粪便及变质食品中，其种属主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconstoc）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptococcus）、肉食杆菌属（Carnobacterium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）等[13]。

哺乳阶段仔猪的肠道发育未成熟，肠道微生物生态平衡未达到稳定状态，此阶段使用抗生素会破坏仔猪肠道微生物的定植过程，进而影响动物肠道免疫力。前人对乳酸菌素的研究多集中在产生菌株的筛选、鉴定和培养条件方面[14-16]，对乳酸菌素应用型产品工艺研究较少。人用药品乳酸菌素标准中规定乳散菌素是脱脂牛乳经嗜酸乳酸菌（Lacidophilus）发酵制成的粉末，但饲料用乳酸菌素暂无产品标准，本研究通过筛选高产乳酸菌素菌株，优化产品发酵工艺，将其变成经济实用的肠道保健品，为绿色健康养殖提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

11株受试乳酸菌，标号S1～11来自安佑集团微生物研究所菌种库；3株指示菌为大肠埃希菌Escherichia coli ATCC25922，鼠伤沙门氏菌Salmonella typhimurium CMCC50115，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923，用于目标菌的抑菌谱实验，来自广东省微生物菌种保藏中心，由安佑研究院微生物研究所保存。酵母浸粉购于安琪酵母股份有限公司；食品级无水葡萄糖购于山东天力药业有限公司；脱脂奶粉购于新西兰恒天然集团；MRS 固体、液体培养基均购自广东环凯生物科技有限公司；MHA、MHB培养基均购自北京路桥技术有限责任公司；过氧化氢酶、胃蛋白酶（猪源）、胰蛋白酶，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 发酵液的制备

将冷冻的11 株乳酸菌甘油管置于室温融化，分别使用无菌接种环挑取适量菌液划线接种于MRS 固体培养基，36 ℃恒温倒置培养36 h。挑单菌落至MRS 液体培养基中，于36 ℃培养8 h，菌液浓度为108CFU/ml，作为液态发酵剂。将液态发酵剂以2%的接种量接种于10%脱脂乳中，置于36 ℃恒温培养箱中培养48 h，发酵脱脂乳在8 000 r/min下离心30 min，弃除沉淀，保留上清液，备用。

1.3 指示菌的培养

分别挑一环试管斜面指示菌接种于10 ml MHB肉汤培养基中，36 ℃恒温培养，使其浊度与0.5 麦氏单位比浊管相同，菌液浓度为108CFU/ml，若培养后浊度偏高，则可用无菌生理盐水调整菌液浊度，4 ℃保藏备用。

1.4 产乳酸菌素菌株初筛

将MHA培养基煮沸冷却至50 ℃左右，无菌操作取1 ml指示菌液至灭菌培养皿中，倾注20 ml MHA培养基，使菌液与培养基混合均匀，置于水平台面，待其凝固。用外径8 mm 的打孔器在完全凝固q 的含菌平板上打孔，用灭菌牙签挑出孔径中培养基，每个孔加入约100 μl 发酵液。将加完发酵液的平板正置于(36±1) ℃培养箱内静置培养16～18 h，观察并测量抑菌圈的大小，筛选出5 株抑菌效果较好的乳酸菌。

1.5 产乳酸菌素菌株复筛

1.5.1 酸抑制作用的排除[17]

用1.0 mol/l的氢氧化钠溶液中和发酵液至pH值4.5，以pH值为4.5的MRS液体培养基为对照组，以大肠埃希菌作为指示菌进行抑菌试验。

1.5.2 过氧化氢作用的排除

将发酵液加入过氧化氢酶处理，以大肠埃希菌作为指示菌，采用打孔法进行抑菌试验，检测抑菌活性。

1.5.3 蛋白酶酶解试验

将发酵液加入胃蛋白酶（猪源）和胰蛋白酶处理，以大肠埃希菌作为指示菌，采用打孔法进行抑菌试验，检测抑菌活性。

1.6 发酵牛奶工艺优化

单因素试验：以10%脱脂乳为基础培养基，S-1菌株接种量为2%，分别用不同的添加量的葡萄糖（0、5、10、15，20 g/l）和酵母粉（0、2、4、6、8 g/l）进行单因素试验，前处理同2.1 节，以大肠埃希菌作为指示菌，用打孔法做抑菌试验，测量抑菌圈直径，确定最优的葡萄糖和酵母膏的添加量。

正交试验：在单因素试验的基础上，接种量(A)、起始pH值（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为考察因素，每个因素设定3个水平，大肠埃希菌作为指示菌，以发酵液的抑菌圈大小（抑菌效果）为考察指标，进行L9（34）正交试验，试验因素和水平见表1。

表1 正交试验设计因素水平

1.7 数据处理

所有试验数据均平行测定3次，原始数据经Excel 2007 处理后，采用SPSS 22.0 进行统计分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的筛选

2.1.1 产乳酸菌素菌株初筛

猪的常见细菌性疾病中，仔猪下痢、渗出性皮炎和副伤寒分别与大肠埃希氏菌、葡萄球菌和沙门氏菌感染有关，故分别以大肠埃希氏菌Escherichia coli ATCC25922，鼠伤沙门氏菌Salmonella typhimurium CMCC50115 和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923 为指示菌，采用打孔法对11 株乳酸菌的抑菌活性进行比较，其结果见表2。由表2可知，所选乳酸菌的发酵液对3 株致病菌均有不同程度的抑菌效果，其中对大肠埃希氏菌的抑菌效果最佳，鼠伤沙门氏菌的抑菌效果次之，金黄色葡萄球菌的抑菌效果最差。S-1、S-2、S-3、S-6和S-9的抑菌圈直径均大于10 mm，抑菌效果较好。

2.1.2 酸抑制作用排除

仔猪细菌性腹泻原因多为产肠毒素大肠杆菌感染，产乳酸菌素菌株复筛抑菌试验指示菌选用大肠埃希氏菌ATCC25922。使用氢氧化钠中和发酵液中的有机酸，以大肠埃希氏菌作为指示菌，打孔法检测抑菌活性，其结果如表3 所示。由表3 可知，当MRS 液体培养基pH 值调为4.5 时，对指示菌无抑制作用，而发酵液在调pH 值后存在抑菌圈，说明发酵液中除有机酸外，存在其他抑菌物质。排除有机酸对抑菌活性影响方面，S-6 活性下降率最高，S-1 活性下降率最低。

表2 初筛乳酸菌的抑菌效果（mm）

表3 有机酸排除试验

2.1.3 过氧化氢作用的排除

使用过氧化氢酶处理发酵液，以大肠埃希氏菌为指示菌，抑菌效果测定结果如表4。由表4可知，经过氧化氢酶处理，S-9的发酵液抑菌活性下降率较大，对其余4株乳酸菌的发酵液抑菌活性影响较小。

表4 过氧化氢作用的排除

2.1.4 蛋白酶水解试验

取S-1、S-2、S-3、S-6和S-9菌株发酵液，经胃蛋白酶（猪源）和胰蛋白酶处理后，以大肠埃希氏菌作为指示菌，抑菌效果见表5。由表5 可知，5 株菌发酵液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌活性均下降，其中S-6菌株对大肠埃希氏菌的抑菌圈最小，其抑菌活性下降了29.54%，但S-1和S-3菌株的抑菌活性下降得较少，分别为6.06%和8.05%，说明其对胃蛋白酶（猪源）和胰蛋白酶不敏感。综上所述，确定S-1菌株发酵液中抑菌物质具有蛋白质性质，即细菌素，且为产乳酸菌素最优菌株，且所用的胃蛋白酶（猪源）和胰蛋白酶筛选效果更贴近实际应用时菌株代谢物的抑菌效果。

表5 蛋白酶水解试验

2.2 发酵牛奶工艺优化

2.2.1 葡萄糖和酵母浸膏添加量对菌株S-1 抑菌活性影响

以10%脱脂乳为基础培养基，添加不同含量的葡萄糖，以大肠埃希氏菌为指示菌，抑菌试验结果见图1。由图1 知随着葡萄糖添加量的增加，抑菌活性先上升后下降，在葡萄糖添加量在10 g/l时，抑菌活性最高，为15.13 mm。酵母浸粉添加量对菌株S-1抑菌活性的影响见图2，随着酵母浸粉添加量的增加，抑菌活性先上升后下降，在酵母浸粉添加量在6 g/l 时，抑菌活性最高，为15.63 mm。

图1 葡萄糖添加量对菌株S-1抑菌活性的影响

图2 酵母浸粉添加量对菌株S-1抑菌活性的影响

2.2.2 发酵条件正交试验

根据单因素试验结果，设计L9（34）正交试验，进一步优化培养条件，试验结果见表6。由表6可知，影响菌株S-1 对大肠埃希氏菌抑菌活性的主次因素为发酵温度＞起始pH 值＞发酵时间＞接种量。本试验最优发酵工艺为：A3B2C2D2，即接种量4%，起始pH 值为6，发酵温度36 ℃，发酵时间48 h。

表6 正交试验结果

3 讨论

3.1 产细菌素乳酸菌的筛选

农业农村部第194 号公告在今年7 月10 日正式发布，要求在2020 年底以前，饲料端“禁抗”，养殖端减抗、降抗为必然，乳酸菌素作为绿色饲料添加剂成为替抗方案的一种选择。产细菌素乳酸菌株筛选早已成为研究热点：尚楠等[16]从32 株人肠道双歧杆菌中分离出具有广谱抗菌效果的双歧杆菌L-SN，尤其对金黄色葡萄球菌、单菌李斯特菌等致病菌有显著作用；张梅梅等[18]对分离自牦牛酸奶中的26 株乳酸菌进行筛选，得到5 株产细菌素乳酸菌，为干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳球亚种，能抑制部分食源性革兰氏阳性和阴性致病菌，对真菌无抑菌活性；张艾青等[19]从传统发酵食品中的267 株乳酸菌中，分离出1 株具有较强抑菌作用的产广谱细菌素的植物乳杆菌P158；Garzon 等[20]从亚马逊野生热带水果中分离出1 株产细菌素的植物乳杆菌，经鉴定细菌素Cys5-4 能够有效抑制大肠杆菌和沙门氏菌生长；Noda 等[21]研究发现，从柑橘水果中分离得到的短乳杆菌174A，产生抗菌多肽174A-β和174A-γ，能够有效抑制单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和变形链球菌。因此，不同来源和不同种属的乳酸菌均可能产生不同种类细菌素。本研究中，从安佑微生物研究所菌种库优选11 株乳酸菌，经筛选得到菌株S-1 产细菌素并有效抑制大肠埃希氏菌，但其菌株鉴定、生物学特性及细菌素成分鉴定还有待进一步深入研究。

3.2 发酵牛奶工艺优化

脱脂乳作为一种天然的培养基，富含蛋白质（酪蛋白为主）、碳水化合物（乳糖为主）、矿物质和维生素，是良好的载体和动物营养源，而葡萄糖和酵母浸粉作为乳酸菌良好的营养源已广泛应用于发酵工业中。Papagianni 等[22]研究发现发酵培养基碳源影响细菌素合成，与蔗糖和果糖相比，葡萄糖作为碳源时，乳酸菌发酵生物量最大且发酵上清液抑菌活性最高。高浓度酵母提取物能够提高细菌素产量和活性[23]。本研究结果表明，在10%脱脂乳中添加葡萄糖与酵母浸粉能够提高菌株S-1发酵产物抑菌活性，与前人研究结果一致，综合生产成本和抑菌效果因素，确定葡萄糖和酵母浸粉最佳添加量为10 g/l和6 g/l。

通常认为细菌素产生与产生菌生长阶段相关联，有的细菌素在菌体细胞生长刚开始时产生，而有的细菌素则在对数生长后期或稳定期才会产生，而发酵工业上，接种量的大小明显影响延滞期的长短，通常采用较大的接种量，缩短发酵周期，以快速到达对数生长期。本研究中最佳接种量为4%，原因可能是菌株S-1 产生细菌素的阶段是生长对数期至稳定期，加大接种量以快速到达对数生长期，有利于细菌素产生，这也与前人的研究一致[24]。本研究中最适培养时间是36 h，其原因可能是培养后期菌体自溶释放蛋白酶降解细菌素，同时细菌素吸附到产细菌素细胞表面引起发酵液中细菌素活性降低[25]。乳酸菌素的产生或许是一种应激调节，对不适于最佳生长环境的一种应激反应[26]，这种应激反应由一个群体感应系统触发，该系统是由一种能够感知特定环境刺激的膜结合组氨酸蛋白激酶和一种介导细胞反应的反应调节器组成[21]。培养温度影响微生物生长繁殖和代谢过程，但其生长率最高时温度与累积代谢产物最高时温度并不相同[27]。乳酸菌的最适生长温度多在30～40 ℃，中性和偏碱性环境并不利于乳酸菌生长[28]。Zhou 等[29]研究发现，植物乳杆BC-25最适生长温度和pH 值为35 ℃和6.8，而产细菌素的最佳温度和pH 值范围分别是27～34 ℃和6.35～6.65，而本试验结果表明最佳发酵温度和起始pH 值分别是36 ℃和6，研究结果间差别可能是来自乳酸菌种属间差异，有待进一步研究。

4 结论

以大肠埃希氏菌ATCC25922、鼠伤沙门氏菌CMCC50115、金黄色葡萄球菌ATCC25923 为指示菌，筛选了实验室保存的11 株乳酸菌代谢产物抑菌活性，排除有机酸和过氧化氢的干扰及通过蛋白酶敏感性试验，得到优产细菌素菌株为S-1。以10%脱脂乳为基础培养基进行优化试验，葡萄糖和酵母浸粉的最佳添加量分别为10 g/l 和6 g/l，最优发酵工艺为接种量4%，起始pH 值为6，发酵温度36 ℃，发酵时间48 h。本研究提供一种动保用乳酸菌素产品发酵方案，经济实用，但其在动物生产上应用效果还需进一步研究。