基于DNA条形码的藏药洪连鉴定研究△

尼玛潘多，李婷，胡小松，刘春生*

1.西藏自治区食品药品检验研究院 西藏自治区藏药标准化研究重点实验室，西藏 拉萨 850000；2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488

洪连为藏族习用药材，始载于《四部医典》。《鲜明注释》云：“洪连门巴随处皆有”；《度母本草》云:“洪连门巴产自南方者为上品；下品分雌、雄两类：能开花者为雄，无花者为雌。”《图谱》云：“雌洪连生于草坪和海滨，叶厚而具皱纹，下垂；花白色，状如狼尾巴；根如松鸡粪，枝被长毛。”《蓝琉璃》云：“随处皆生，分雌雄两种，雄者花蓝色，状如松鸡粪；根状如虫。”《甘露本草明镜》云：“本品根呈灰色，圆锥形，具须根；叶绿色，厚具皱纹，微粗糙，叶背微灰色，卵形或剑形，边缘有锯齿，先端急尖或钝圆；叶柄紫红色，细面长；花紫红色，果实小，黄紫色。”各地藏医多用玄参科的兔耳草、短管兔耳草、全缘兔耳草等植物为洪连门巴，其中，短管兔耳草的形态特征与上述文献记载更相近，故为兔耳草的正品[1]。具有清热解毒、行血调经的作用，在传统藏医中用于治疗全身发热、肾炎、肺病、高血压、动脉粥样硬化、月经不调、综合物中毒及“心热”等症[2]。洪连在临床上的应用较为广泛，是不少藏成药的主要组成，如二十味沉香丸、二十五味大汤丸、二十六味通经丸、八味沉香利尿丸、二十五味獐芽菜丸等。

2015年版《中华人民共和国药典》收载的洪连为玄参科短筒兔耳草LagotisbrevitbaMaxim.的干燥全草，1995年版《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药第一册收载玄参科短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim或全缘兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草，《云南省中药材标准》1996年版收载革叶兔耳草LagotisalutaceaW. W. Smith.全缘兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草。

但各地藏区(西藏、四川、青海、云南、甘肃)除使用上述标准规定的品种外也有使用其他种的兔耳草。鉴于洪连药材来源复杂，品种繁多，极易造成药材混乱，加之兔耳草属的植物形态相似，不能准确区分。因此，对兔耳草属药材进行准确鉴定有着非常重要的意义。

目前对兔耳草的研究多集中在对短筒兔耳草的研究，且对其化学成分[3-7]研究较多，未见其有采用DNA条形码对其鉴定的报道。近年来，DNA条形码越来越受到关注。与传统鉴定方法相比，DNA条形码技术以物种的遗传信息为鉴定依据，不受植物生长环境、发育阶段、样品形态和组织部位的限制，具有通用性、客观性、准确性等特点[8]。因此DNA条形码已经广泛应用于药材鉴定的各个领域，如植物药、动物药等。

本研究收集了12批来源于各藏区的洪连药材，采用ITS及其叶绿体序列对其进行DNA鉴定，旨在对洪连进行准确鉴定，为进一步藏药资源的开发与合理利用提供支持。

1 材料

1.1 仪器

BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR仪(德国Biomerta公司)，Bio-Rad 型电泳仪，(北京六一仪器厂)，JY-SPDT型水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)，BG-gdsAUTD520凝胶成像分析系统(南京华奥仪器有限公司)，MM400冷冻混合球磨仪(德国RETSCH公司)。

1.2 试药

广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(TIANGEN)，2×Taqplus per mastermix(含染料)(北京博迈德发展有限公司)；样品收集于各藏区，具体样品信息见表1。其中11、12号样品由四川省食品药品检验检测院黎跃成老师提供，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为玄参科兔耳草属植物。

表1 12份洪连样品信息

2 方法

2.1 DNA提取

取适量药材用75%乙醇进行表面擦拭，加入液氮，用球磨仪迅速将其研成粉末，采用光谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，具体操作见说明书。提取的样品DNA于-20 ℃保存备用。

2.2 PCR扩增

采用30 μL反应体系，样品总DNA 2 μL，正反向引物(ITS引物：F-5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R-5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；psbA-trnH引物：F-5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′R-5′-CGCGCA-TGGTGGATTCACAATCC-3′；引物各1 μL，2×Mix聚合酶15 μL，ddH2O补足。

PCR反应程序：ITS序列：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环，至72 ℃ 5 min；psbA序列：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30个循环，至72 ℃ 7 min。

2.3 测序分析

将所得PCR产物经1.0%～1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测于500～750 bp可见单一明亮的条带。剩余PCR产物经北京小师弟商贸有限公司进行一代测序分析。

2.4 数据处理

测序结果进行ContigExpress进行正反拼接，DNAMAN拼接及序列比对，采用BLAST方法对获得的DNA序列在GenBank-NCBI中进行相似性同源查询，采用MEGA5.0对得到的序列进行比对，分析种内、种间的遗传变异，计算Kimura2-parameter(K2-P)遗传距离，构建NJ进化树。

3 结果

3.1 ITS序列数据分析结果

经DNAMAN多序列比对，序列总长552 bp，各序列相似度达到97.43%，存在34个变异位点，见表2。从表中可得出在107 bp时短管兔耳草无碱基，全缘兔耳草为碱基T，紫叶兔耳草为碱基A，故能将三者进行区分。

根据其遗传距离构建N-J树，由图1可知，1、2、5、9、10共5个样品与下载序列短筒兔耳草聚为1支，3、4、7、8、11、12共6个样与全缘兔耳草聚为1支，6号样与紫叶兔耳草聚为1支。

图1 洪连样品ITS N-J树

3.2 psbA-trnH序列数据分析结果

序列长度约为250 bp，存在12个变异位点，见表3。在136 bp处，全缘兔耳草为碱基T，紫叶兔耳草为碱基A，短筒兔耳草无碱基，因此能将3个种很好地区分。根据遗传距离构建N-J树。由图3可知，与ITS结果鉴定结果相同，1、2、5、9、10共5个样品与下载序列短筒兔耳草聚为1支，3、4、7、8、11、12共6个样与全缘兔耳草聚为1支，6号样与紫叶兔耳草聚为1支。

表2 ITS序列变异位点

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；*表示在此处未有碱基。

表3 psbA-trnH序列变异位点

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；G.鸟嘌呤。

图2 洪连样品psbA-trnHN-J树

4 讨论

准确的基原鉴定是保障药材质量的根本，因各种原因，民族药材基础研究薄弱，基础工作不足，质量控制及监管整体水平较低，存在的主要问题是实际使用的药材与标准不相符，标准执行上存在一定问题[9-10]，目前洪连药材的临床用药与现有标准存在很大差距，市售药材的来源较多，药材在流通中以同属多种植物作为替代品的现象很常见[11]。因此对洪连药材进行准确鉴别具有非常重要的意义。

本研究采用ITS及psbA-trnH序列对12批兔耳草属的药材进行鉴别，结果显示，12批的兔耳草来源于3个种，分别是短管兔耳草、全缘兔耳草与紫叶兔耳草。根据遗传距离构建N-J树3种兔耳草明显聚为3支，表明DNA条形码能准确区分兔耳草属的各个种，并且鉴定结果与形态鉴别结果相吻合。但鉴于本研究所选取样本有限，想要实现快速精准鉴别，还需要对更多样本的DNA进行扩增，以便积累更多的数据。

本研究以藏药洪连的精准鉴别为切入点，解决了洪连药材受样品形态、植物生长期、有花无花以及人为主观因素等限制的问题[12]，为藏药的准确鉴别提供了可靠的方法，为藏药资源进一步的开发与利用奠定基础，同时为藏药的质量与临床安全用药提供了参考。