基于转录组的苹小卷叶蛾杀虫剂靶标及解毒代谢相关基因分析

孙丽娜, 张怀江, 刘孝贺, 仇贵生

(中国农业科学院果树研究所, 辽宁兴城 125100)

苹小卷叶蛾Adoxophyesorana是苹果、桃、樱桃、山楂、茶、棉花和豆类等多种果树及农作物的主要害虫。因其为害果树，故果树上的苹小卷叶蛾又称小黄卷叶蛾、远东卷叶蛾、苹褐带卷蛾(何振昌, 1997)。该害虫的幼虫不仅取食植物幼叶、花，还可转果为害多个果实，甚至能啃食套塑膜袋为害果实。近年来，由于果树产业结构调整和种植模式变化使该虫在我国北方果区发生为害逐渐加重，为害面积也不断扩大(胡雅辉等, 2009)。适逢多雨高湿天气，也会导致该虫的暴发(孙丽娜等, 2015a)。为了减轻该虫对果树造成的危害，化学防治是目前防治该虫最有效的途径之一。田间验证发现，氯虫苯甲酰胺、虫酰肼、甲氧虫酰肼、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和虱螨脲对防治苹小卷叶蛾均具有较好防效(孙丽娜等, 2014)。然而，由于苹小卷叶蛾潜居于卷叶中，难以完全接触药剂，且有些药剂长期施用，使该虫产生了抗药性。

随着高通量测序技术的发展应用，转录组测序技术越来越多地应用于昆虫毒理学研究领域，为无参考基因组害虫研究提供了技术支持。近年来，国内外学者先后利用转录组测序技术，分析了卫生害虫(冈比亚按蚊Anophelesgambiae)、大田作物害虫(灰飞虱Laodelphaxstriatellus、玉米螟Ostriniafurnacalis)、蔬菜害虫(小菜蛾Plutellaxylostella)、果树害虫(桔小实蝇Bactroceradorsalis)、林业害虫(舞毒蛾Lymantriadispar)等对杀虫剂代谢、解毒及抗药性机制，涉及不同种类杀虫剂如有机磷、菊酯类、二酰胺类、苯基吡唑类等(Heetal., 2012; Zhangetal., 2012; Houetal., 2014; Caoetal., 2015; Cuietal., 2017; Domingosetal., 2017)。笔者前期研究表明，我国苹小卷叶蛾的有效防治药剂主要有虫酰肼、甲氧虫酰肼、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯虫苯甲酰胺、虱螨脲等(孙丽娜等, 2014)。虫酰肼、甲氧虫酰肼和虱螨脲是昆虫生长调节剂，作用靶标为蜕皮激素受体，甲胺基阿维菌素苯甲酸盐作用靶标为氯离子通道蛋白，氯虫苯甲酰胺的靶标为昆虫鱼尼丁受体(www.irac-online.org)。害虫对杀虫剂产生抗药性的过程，与杀虫剂靶标的敏感性、解毒酶的活性密切相关(高希武, 2012)。

本文采用Illumina HiSeqTM2000测序平台开展苹小卷叶蛾的转录组测序研究，挖掘对苹小卷叶蛾具有较好防效的杀虫剂的作用靶标基因及该虫对杀虫剂的主要解毒代谢相关基因，为相关基因的克隆、表达及功能研究及进一步开展苹小卷叶蛾抗药性的分子机制和治理策略奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 害虫饲养

供试虫源采自辽宁兴城(40.61°N, 120.73°E)，在实验室内人工气候箱中于温度为25±1℃、相对湿度70%±5%、光周期为16L∶8D的条件下用金冠苹果Malusdomesticacv. Golden Delicious叶片饲养2代后，取卵、幼虫、蛹和成虫混合样为供试材料，于液氮速冻后-80℃保存备用。

1.2 cDNA文库构建和测序

用TRIzol试剂提取苹小卷叶蛾卵约200粒、幼虫20头、蛹20头、成虫20头总RNA(孙丽娜等, 2015b)。总RNA的提取、质量分析、cDNA文库的建立及测序工作由华大基因有限公司(深圳)完成。采用Illumina HiSeqTM2000系统进行测序(刘长莉等, 2013)。

1.3 生物信息学分析

利用Nesoni Tools程序对原始reads进行质量预处理，使用Trinity v 2.0.6对得到的有效读序(clean reads)组装unigenes，并使用Blast2go软件将拼接的unigenes与NCBI的NR(非冗余蛋白质数据库), NT(核酸数据库), Swiss-Prot(蛋白质注释信息数据库), GO(Gene Ontology), COG(Clusters of Orthologous Groups), KOG(euKaryotic Orthologous Groups), KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库比对及信息注释(Grabherretal., 2011)。

1.4 杀虫剂靶标基因的鉴定及表达模式分析

根据unigenes序列与NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG数据库比对进行功能注释，在转录组中搜索防治苹小卷叶蛾常用杀虫剂靶标基因蜕皮激素受体、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱受体、钠离子通道、氯离子通道、γ-氨基丁酸、几丁质酶、鱼尼丁受体基因等。以核糖体蛋白S15基因为内参基因，参照笔者之前研究方法(Sunetal., 2016)检测6个杀虫剂靶标基因在苹小卷叶蛾不同发育时期的表达水平，基因名及引物见表1。卵为1-6日龄混合样120粒，1-5龄幼虫各10头，蛹分别为2, 4, 6, 8和10日龄混样10头，成虫分别为1, 3和5日龄混样10头。试验于Bio-Rad CFX Connect实时荧光定量PCR仪上进行，样品重复3次，另加3个无模板的阴性对照。反应体系(20 μL): 1 μL稀释10倍的cDNA(20 ng), 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 2×SYBR Green I 10 μL, 加ddH2O至20 μL。反应程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环。每个基因分别以2龄幼虫中的表达量为标准，根据2-ΔΔCt相对定量法统计各基因在不同发育时期的表达量差异，每个发育阶段重复3次(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Primers in qPCR

1.5 解毒代谢相关基因的挖掘及代谢通路、进化关系分析

通过将unigenes序列与NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG数据库进行比对，在转录组中筛选与抗药性相关的细胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶基因等。提取序列，鉴定具有完整ORF的基因，采用MEGA6序列分析软件中邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建分子进化树(刘长莉等, 2013; Tianetal., 2018)。同时分别按照Feyereisen (2005)、Oakeshott等(1999)、Ranson和Hemingway(2005)的方法对细胞色素P450、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶进行分类。

1.6 数据分析

采用SPSS Statistics 20.0分析系统，各处理平均数经过方差分析后，用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果

2.1 苹小卷叶蛾转录组组装结果

经过测序质量控制，共得到52 962 442 clean reads，最终对转录组的clean data进行拼接共得到48 610条unigene，平均长度为796 bp，unigene中超过1 000 bp的数量为12 694，其不同长度的具体分布图如图1所示。转录组原始数据提交至NCBI SRA数据库中，登录号为SRP143426；组装的clean data提交至NCBI TSA数据库(GenBank登录号: GGMW00000000)。

图1 苹小卷叶蛾转录组拼接后的unigenes长度分布Fig. 1 Length distribution of the assembled unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

2.2 苹小卷叶蛾转录组中unigenes的功能注释及序列特征

将组装得到的48 610个unigenes序列与NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG数据库比对，通过选择BLAST参数E-value不大于1e-5和HMMER参数E-value不大于1e-10且有注释信息的unigene，结果如表2所示。根据序列同源性比对，NR数据库中的16 803个注释基因源自300余个物种，分布如图2所示。其中5 428个基因与甜菜夜蛾Spodopteraexigua同源，3 308个基因与家蚕Bombyxmori同源，与2物种同源的注释基因占总注释基因的67.61%；其后依次是与柑橘凤蝶Papilioxuthus、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster和冈比亚蚊Anophelesgambiae同源的基因分别为464, 321和177个，分别占总注释基因的3.59%, 2.48%和1.37%；与其他物种同源的基因占总注释基因的24.95%。

2.3 苹小卷叶蛾转录组中杀虫剂靶标基因的预测及表达模式分析

根据苹小卷叶蛾防治中药剂的应用，筛选药剂的靶标基因。通过比对NR, NT, Swiss-Port, KEGG数据库注释的序列，搜索苹小卷叶蛾转录组中杀虫剂靶标基因155个(表3)，与几丁质酶相关的基因在苹小卷叶蛾中数目最多，占杀虫剂靶标unigene的47.10%。155个unigene与NCBI数据库进行在线比对，鉴定出1个蜕皮激素受体基因、2个胆碱酯酶基因、1个氯离子通道基因、1个几丁质酶基因和1个鱼尼丁受体基因。

qPCR结果显示，6种靶基因在苹小卷叶蛾不同发育阶段均呈现不同的趋势。随着苹小卷叶蛾发育蜕皮激素受体基因表达逐渐下调(图3: A)，该基因在卵期的表达量分别是1-5龄幼虫、蛹和成虫期的17.68, 24.62, 29.67, 27.61, 28.60, 46.76和72.61倍(P<0.05)。乙酰胆碱酯酶1基因在3龄和5龄幼虫中表达量较高(图3: B)(P<0.05)；乙酰胆碱酯酶2基因则蛹期表达量最高(图3: C)(P<0.05)。而蛹和成虫期的氯离子通道蛋白基因表达量显著高于卵期和幼虫期(图3: D)(P<0.05)。几丁质酶基因在3-5龄幼虫期的表达量较高，4龄幼虫期表达量分别是卵期、蛹期和成虫期的22.89, 35.63和450.75倍(图3: E)(P<0.05)。鱼尼丁受体基因在苹小卷叶蛾卵、1龄幼虫、蛹和成虫期的表达量较高，且在幼虫期表达逐渐下调，其在卵期的表达量分别是4和5龄幼虫的12.27和13.39倍(图3: F)(P<0.05)。

表2 苹小卷叶蛾转录组unigenes注释统计Table 2 Statistical of the annotated unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

图2 苹小卷叶蛾转录组unigenes在NR数据库中的物种分布图Fig. 2 Species distribution of unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome in NR database

表3 苹小卷叶蛾转录组中杀虫剂靶标基因数目统计Table 3 Number of insecticide target genes inthe Adoxophyes orana transcriptome

2.4 苹小卷叶蛾转录组中解毒代谢相关基因的挖掘、代谢通路及进化关系分析

苹小卷叶蛾转录组中发现69个羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE) unigene, 66个谷胱甘肽-S-转移酶(glutathion S-transferase, GST)unigene和205个细胞色素P450 (cytochrome P450)unigene。解毒代谢相关基因中细胞色素P450基因数目占3种解毒酶基因的71.6%，远多于羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶基因的数量，这与细胞色素P450酶在昆虫物质代谢过程中极其重要的地位有关。

根据NR注释结果与KEGG通路分析，过滤掉短片段、等位基因后，发现20个CarE unigene与drug metabolism-other enzymes (ko00983)通路有关。其中12个CarE unigene具有完整的ORF。

在KEGG数据库中，31个GST unigene与drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)通路相关，32个GST unigene与metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相关，差异unigene为unigene68409_All。

人工剔除不能正确翻译、与微生物具有高度同源性和长度小于700 bp的unigene后，从205个细胞色素P450相关的unigene中鉴定出66个P450 unigene，平均长度1 762 bp。根据KO注释结果，对P450 unigene进行分类，其中14个unigene属于family3, 10个属于family4， 22个属于family6， 8个属于family9。通过KEGG数据库通路分析，其中30个P450 unigene均与drug metabolism-other enzymes (ko00983), drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)和metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相关。且30个P450 unigene中12个属于family3， 10个属于family6， 8个属于family9。

获得12个具有完整开放阅读框的苹小卷叶蛾CarE基因，通过与其他已知昆虫的CarEs序列进行NJ聚类分析(图4)，结果显示，9个基因为G类，即鳞翅目保幼激素类基因；1个为D类，即moth integument esterase withDrosophilahomologs基因，1个属于E类即β-酯酶基因，1个属于Gliotactin类基因。

图3 苹小卷叶蛾6个杀虫剂靶标基因的发育表达模式Fig. 3 Expression profiles of six insecticide target genes in Adoxophyes orana at different developmental stagesA: 蜕皮激素受体基因Ecdysone receptor gene; B: 乙酰胆碱酯酶1基因Acetylcholinesterase 1 gene; C: 乙酰胆碱酯酶2基因Acetylcholinesterase 2 gene; D: 氯离子通道蛋白基因Chloride channel gene; E: 几丁质酶基因Chitinase gene; F: 鱼尼丁受体基因Ryanodine receptor gene. Eg: 卵Egg; L1-5: 分别为1-5龄幼虫1st-5th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; Ad: 成虫Adult. 以核糖体蛋白S15基因为内参基因; 以2龄幼虫中的表达量为标准。图中数据为平均值±标准误，柱上不同小写字母表示基因表达量在不同发育阶段间差异显著(P<0.05, Duncan氏检验)。The ribosomal protein S15 gene was used as the reference gene, and the expression level of gene in the 2nd instar larva was taken as the standard. Data in the figure are mean±SE, and different small letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, Duncan’s test).

AoGSTs与其他昆虫GSTs之间的进化关系的结果表明(图5)，AoGSTs被划分为5个亚家族，分别为Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，基因数分别为4, 5, 1, 10和10。其中尚未发现有基因类属Zeta家族基因。序列比对发现，CL3513.contig2 unigene与同为果树害虫的苹果蠹蛾CydiapomonellaGSTd1(GenBank登录号: ACJ23087.1)的氨基酸序列一致性最高，达81.86%。

根据ORF编码氨基酸序列，共发现18个完整的P450基因，与其他27个P450基因的氨基酸序列进行系统发育分析(图6)。结果表明，苹小卷叶蛾转录组中的18个P450基因全部聚到CYP3集团(CYP3 clade)，未有P450聚集到CYP2集团(CYP2 clade)，CYP4集团(CYP4 clade)和线粒体集团(mitochondrial clade)。

图4 基于氨基酸序列的苹小卷叶蛾转录组CarE unigene系统发育分析(邻接法)Fig. 4 Phylogenetic analysis of CarE unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)D: Moth integument esterase with Drosophila homologs; E: Diptera β-esterases with hemipteran sister group; F: Nonlepidopteran juvenile hormone esterases and like enzymes; G: Lepidopteran JHE’s and Anopheles sister group; H: Glutactin and like enzyme; K: Uncharacterized putative neuroreceptor group; M: Gliotactin; L: Neuroligins. 菱形所标基因为苹小卷叶蛾CarE unigene。CarE unigenes of A. orana are marked with black rhombus. 其他基因来源物种Origin species of other genes: Aaeg: 埃及伊蚊Aedes aegypti; Dmel: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster; Bmor: 家蚕Bombyx mori; Cfum: 云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana; Msex: 烟草天蛾Manduca sexta; Agam: 冈比亚按蚊Anopheles gambiae; Apol: 多音天蚕Antheraea polyphemus; Tcas: 赤拟谷盗Tribolium castaneum.

图5 基于氨基酸序列的苹小卷叶蛾转录组GST unigene系统发育分析(邻接法)Fig. 5 Phylogenetic analysis of GST unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)黑色圆点所标基因为苹小卷叶蛾GSTs基因。GST unigenes of A. orana are marked with black circles. 其他基因来源物种Origin species of other genes: Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Prap: 菜粉蝶Pieris rapae; Csup: 二化螟Chilo suppressalis; Bmor: 家蚕Bombyx mori; Dant: 葱蝇Delia antiqua; Slit: 斜纹夜蛾Spodoptera litura; Cmed: 稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis; Hvit: 黄野螟Heortia vitessoides; Lmig: 东亚飞蝗Locusta migratoria; Agam: 冈比亚按蚊Anopheles gambiae; Cpom: 苹果蠹蛾Cydia pomonella; Pxut: 柑橘凤蝶Papilio xuthus; Ofur: 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Aper: 柞蚕Antheraea pernyi.

图6 基于氨基酸序列的苹小卷叶蛾转录组P450 unigene系统发育分析(邻接法)Fig. 6 Phylogenetic analysis of CYP unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)三角号所标基因为苹小卷叶蛾CYP unigene。CYP unigenes from A. orana are marked with black triangles. 其他基因来源物种 Origin species of other genes: Dpas: 欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella; Slit: 斜纹夜蛾Spodoptera litura; Bmor: 家蚕Bombyx mori; Obru: 冬尺蠖Operophtera brumata; Dsim: 拟果蝇Drosophila simulans; Dbus: 巴氏果蝇Drosophila busckii; Dmel: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster; Zcuc: 瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae; Csec: 白蚁Cryptotermes secundus; Agos: 棉蚜Aphis gossypii; Bman: 野桑蚕Bombyx mandarina; Papo: 阿波罗绢蝶Parnassius apollo; Dple: 帝王蝶Danaus plexippus; Cmed: 稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis; Lstr: 灰飞虱Laodelphax striatella; Nden: 绿虾Neocaridina denticulata.

3 讨论

新一代高通量测序技术已广泛用于昆虫分子标记、抗药性相关基因的挖掘、昆虫与其他生物互作研究等方面。本研究利用Illumina测序技术对苹小卷叶蛾的转录组进行测序和分析。在NR数据库中，苹小卷叶蛾注释到甜菜夜蛾的序列信息最多，源于两种昆虫均属鳞翅目害虫，亲缘关系相对较近。此现象在其他物种转录组研究中也得到证实，如桃小食心虫Carposinasasalii的转录组中6 684个基因与家蚕Bombyxmori中的同源，占比达39.8%；梨小食心虫Grapholitamolesta的触角转录组52.2%的序列注释到帝王蝶Danausplexippus的序列(Lietal., 2015; 孙丽娜等, 2018)。目前，尚未见苹小卷叶蛾基因组报道，对该虫转录组的测定和分析，可同时获得多个靶标基因、解毒代谢相关基因的序列信息，加速杀虫剂对此害虫作用机制的研究。

本研究qPCR结果发现，苹小卷叶蛾杀虫剂靶标基因的表达模式与其他害虫存在差异。苹小卷叶蛾EcR基因在卵期的表达量最高(图3: A)，而茶尺蠖Ectropisobliqua和烟粉虱Bemisiatabaci的EcR基因均在成虫期表达量最高(李良德等, 2015; 杨春红等, 2016)。另有研究发现在黑腹果蝇和西方蜜蜂EcR基因分别编码3个和2个异构体，且功能不同(Benderetal.,1997; Melloetal., 2014)。Mello等(2014)发现,在蜜蜂幼虫和蛹发育过程中异构体A高表达，而在胚胎发育过程中异构体B高表达，这表明不同异构体在不同发育时期可能存在不同的调控作用。根据转录组数据，在苹小卷叶蛾中尚未发现异构体，苹小卷叶蛾中是否也存在其他异构体，还有待进一步证实。有机磷杀虫剂通过抑制害虫乙酰胆碱酯酶的活性杀害昆虫。苹小卷叶蛾Ache1在3龄幼虫期表达最高(图3: B)，而Ache2在蛹期表达最高(图3: C)。蓖麻蚕Philosamiacynthiaricini乙酰胆碱酯酶基因Pcrace2在成虫期表达量最高(刘娟等, 2013)，褐色橘蚜Aphiscitricidus乙酰胆碱酯酶基因Tcace1和Tcace2从若虫到成虫期表达量逐渐升高(牟星, 2017)。对于苹小卷叶蛾几丁质酶基因，其在3-5龄幼虫期持续高表达(图3: E)，不同于小菜蛾PxyChi基因，其在成虫期表达量最高( 申建梅等, 2018)；与棉铃虫Helicoverpaarmigera和舞毒蛾相似，HaCHT4基因在棉铃虫2龄幼虫期的表达量最高，舞毒蛾中该基因以2龄与4龄幼虫期表达水平最高(刘建红等, 2015; 麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔等, 2019)。二酰胺类杀虫剂是目前防治鳞翅目害虫较流行的杀虫剂，其作用靶标昆虫鱼尼丁受体。该类药剂正在果树害虫的防治中推广应用，其对苹小卷蛾防治效果较好。苹小卷叶蛾鱼尼丁受体基因在卵中表达量最高(图3: F)，这与已报道的果树鳞翅目害虫该基因的表达模式存在较大差异。笔者前期研究发现桃小食心虫和梨小食心虫中，RyR基因在蛹期和成虫期均高表达，且雄虫中的表达量显著高于雌虫(孙丽娜等, 2015b; Sunetal., 2016)。杀虫剂靶标基因在不同发育时期的表达丰度与药剂活性是否存在相关性，该研究也有待进一步研究。

害虫长期暴露于杀虫剂中易产生抗药性，CarEs, GST和细胞色素P450与害虫抗药性密切相关，并称为昆虫三大解毒酶系，均属于多基因编码的超家族酶系。根据Oakeshott等(1999)的分类方法，对苹小卷叶蛾羧酸酯酶的进化关系进行分析。与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、白粉虱和飞蝗不同，本文鉴定的苹小卷叶蛾中具有完整开放阅读框的12个羧酸酯酶基因中的9个基因为G类基因，即鳞翅目昆虫保幼激素酯酶基因，类属于第二功能组，与激素降解相关；CL4070.contig2属于E类(图4)，即β酯酶。β酯酶、保幼激素酯酶属于分泌型催化酯酶，β酯酶基因的数目在昆虫中发现得并不多，在鳞翅目昆虫的主要功能是降解性信息素(Durandetal., 2010; 张建琴, 2014)。研究认为第一功能组(A-C簇)主要由α酯酶组成，这些酶类可对有毒物质进行代谢解毒，已有报道表明一些α酯酶参与昆虫对有机磷杀虫剂的抗性，然而在鉴定的所有完整开放阅读框基因中并未发现A-C簇的CarEs基因，故本文未把A-C簇的其他基因列入。

GST主要分3类，Ⅰ类为Delta亚家族，Ⅱ类包括Sigma, Theta, Zeta和Omega 4个亚家族，Ⅲ类为Epison亚家族(Ranson and Hemingway, 2005)。本文鉴定的AoGSTs被划分为5个亚家族，分别为Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，多数AoGSTs分布在Delta和Epsilon家族，多于苹果蠹蛾GSTs在两个家族的分布(郭金梦, 2018)。通过比较敏感和抗性品系昆虫体内解毒酶活性发现，害虫抗药性产生可能与机体内GSTs活性提高相关(Huangetal., 1998; Vontasetal., 2001; Heetal., 2009)。Li等(2007)研究发现，GSTs活性提高包括基因扩增和基因过量表达2种作用机制，并且介导昆虫抗杀虫剂的GSTs基因主要来自Delta和Epsilon 2个亚家族，这两个家族被认为是昆虫抗药性形成的主要原因(Shietal., 2012)。研究认为埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊对DDT的抗药性可能分别被AaGSTD1, DmGSTD1和AgGSTE2所诱导形成，家蝇Muscadomestica对有机磷类杀虫剂的抗药性由MdGSTD3介导产生(Wangetal., 1991; Grantetal., 1992; Tang and Tu, 1994; Lumjuanetal., 2005)。在果树鳞翅目害虫的抗药性研究中，Liu等(2014)研究发现苹果蠹蛾CpGSTd1基因在毒死蜱和高效氯氟氰菊酯代谢解毒过程中扮演重要角色。本研究中苹小卷叶蛾中GST基因CL3513.contig2与CPGSTd1的氨基酸序列一致度最高，推测苹小卷叶蛾中的CL3513.contig2在有机磷和拟除虫菊酯类药剂的代谢中也起到举足轻重的作用。

P450参与多种杀虫剂的代谢，是导致昆虫产生抗药性的关键基因之一。根据P450成员间的进化及亲缘关系，P450可分为CYP2集团(CYP2 clade), CYP3集团(CYP3 clade), CYP4集团(CYP4 clade)和线粒体P450集团(mitochondrial P450 clade)(Feyereisen, 2006)。昆虫所特有的P450家族主要有CYP6, CYP9, CYP12, CYP18和CYP28，其中CYP6, CYP9和CYP28属于CYP3集团，CYP12属于线粒体集团，CYP18属于CYP2集团(Feyereisen, 2005; Lietal., 2007; Daietal., 2014)。CYP3集团是包含昆虫P450家族最多的集团，与昆虫代谢外源物质相关的家族属于此集团，本研究中鉴定的18个CYP基因均属于CYP3集团基因，除CL1119.contig2外，其余17个分属于CYP6和CYP9家族基因。根据所属通路分析，这18个基因均可参与药物代谢，与害虫的抗药性密切相关。