水稻OsDTH13 基因编辑突变体的创制与分析

石雨鹭，郑 瑞，靳亚军，栾维江

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

水稻成花素是抽穗开花的促进因子，是一种在叶片中形成并转运到顶端分生组织起作用的小分子蛋白.该蛋白因具有磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）的结合结构域，属于PEBP蛋白家族.PEBP 基因家族在进化上十分保守，广泛存在于细菌、动物和植物中[1].就植物中的PEBP 编码基因而言，根据编码氨基酸序列的同源性，又分为FT-like、TFL-like 和MFT-like 3个亚家族[2].FT-like 和TFL-like亚家族基因可能是由MFT-like 亚家族基因进化而来[1].

植物成花素基因最早在拟南芥中得到鉴定，拟南芥基因组包含8个PEBP 编码基因[3]，其中已知的FT是成花素，可以促进拟南芥的开花；TFL1 是拟南芥的反成花素，抑制其开花[4].油菜基因组包含26个PEBP 基因[5].大豆基因组包含23个PEBP 基因[6]，其中GmFT2a和GmFT5a 可以调控开花时间，促进大豆的开花[7].水稻基因组包含19个PEBP 基因，其中，13个为FTLike 成员，已明确功能的Hd3a 和RFT1 分别是水稻在短日照（SD）和长日照（LD）条件下的成花素基因[8]，可以在SD 和LD 条件下促进水稻的成花，其余成员的功能未知；4个属于TFL-like 成员，可能具有反成花素作用；2个属于MFT-like 成员，即OsMFT1 和OsMFT2，它们在种子发育和萌发过程中呈现出较高的表达水平[9]，过量表达OsMFT1 可推迟开花，并且改变穗型，2个成员的详细功能还不明确.

CRISPR/Cas9 系统是近几年发展的一种准确、高效、应用广泛的基因编辑技术，与锌指核酸酶技术（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶技术（TALENs）相比优势突出[10].CRISPR/Cas9 系统作用机理简单，仅需通过1个sgRNA（single guide RNA） 和核酸酶（Cas9）就可以实现基因的定点编辑[11-12].在gRNA 的引导下识别将要切割的靶序列，由Cas9 蛋白在靶点附近切割DNA 双链产生染色体双链断裂，随后通过非同源末端连接进行修复，由于修复的不准确导致碱基插入或缺失，从而造成基因突变[13].目前，已有研究表明，CRISPR/Cas9 系统在拟南芥、小麦、水稻、玉米、烟草以及苔藓植物中得到了应用[14].

本研究利用CRISPR/Cas9 技术对水稻的OsDTH13基因进行定点编辑，并对获得的编辑植株进行测序分析，明确其编辑突变类型，得到了编辑突变体，为后续OsDTH13 基因的功能研究提供实验基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

粳稻品种中花11（Oryza sativa L.ssp. Japonica cv.Zhonghua11）及其转基因植株均种植于天津师范大学实验田，田间保持常规管理.

1.2 靶位点选择及引物设计

利用E-CRISPR（http：//www.e-crisp.org）在线设计平台对OsDTH13 基因的编码区序列进行分析，选用2个GN19NGG 特征的序列作为编辑靶位点（分别为TG1 和TG2），以提高编辑效率.这2个靶点在目的基因的第一个外显子上，GC 含量分别为60%和50%，发夹结构较少. 将设计好的靶点在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，证实其具有良好的特异性，脱靶概率低.

1.3 CRISPR/Cas9 载体的构建

分别取2个靶点TG1 和TG2 的上下游引物各10 μL，进行退火反应.PCR 反应程序为：95℃，3 min；以0.1 ℃/s 的速率降温至22 ℃，获得靶点特异片段.含有sgRNA 的OsU6SK 载体用限制性内切酶BbsⅠ进行过夜酶切，回收酶切产物，将其分别与2个靶位点特异片段于16 ℃过夜连接.连接产物热激转化后，挑取单克隆进行菌液PCR 鉴定.鉴定正确的阳性质粒与含有Cas9 的35S-Cas9-SK 载体及双元pCAMBIA1300载体，分别用相应的限制性内切酶进行酶切，回收后进行连接，获得可以转化水稻的双元重组载体.

1.4 转基因植株的分子鉴定

将构建成功的CRISPR/Cas9 重组载体转入农杆菌，利用农杆菌介导的遗传转化法获得转基因植株.将转基因植株移栽至实验田，待其生长到5 叶期，收集叶片，用CTAB 法提取水稻基因组DNA.以载体中的特异性潮霉素基因作为选择标记进行PCR 分子鉴定.所用PCR 程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸7 min，4 ℃保存.

1.5 转基因植株的突变类型分析

由于2个靶点TG1 和TG2 的位置相近，因此可以用同一对引物进行检测. 依据OsDTH13 的基因组序列，在靶点序列上下游约250 bp 处设计靶点编辑检测引物进行PCR 扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行检测.将PCR 产物送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果与野生型序列比对分析.如测序结果为套峰，则利用在线平台DSDecodeM（http：//dsdecode.scgene.com/）对突变位点进行解码，并用凝胶电泳进行验证，确定突变类型.

2 结果与分析

2.1 OsDTH13 序列分析及靶位点的选择

OsDTH13 基因的DNA 序列长1576 bp，含有4个外显子和3个内含子，编码序列总长558 bp，编码186个氨基酸，其结构如图1 所示.

图1 OsDTH13 基因结构及靶点位置Fig.1 Structure of OsDTH13 gene and the position of target sites

依据OsDTH13 的基因结构特点及靶点设计原则，在第一个外显子内筛选出了2个打靶效率高、特异性好的靶位点TG1 和TG2，分别位于ATG 后27～46 bp及48～67 bp.由于FT-like 家族成员的同源性较高，本研究通过BLAST 搜寻比对，发现这2个靶点的脱靶率低，不会造成该家族与其序列相似成员的编辑.

2.2 CRISPR/Cas9 载体构建

分别将2个靶点的正反向引物进行退火反应，获得了寡聚二聚体，连接至含有sgRNA 的OsU6SK 质粒骨架上，获得带有靶点序列的sgRNA 融合载体（OsU6-SK-TG1 和OsU6-SK-TG2）. 重组载体热激转化后，挑取单克隆进行菌液PCR 扩增，得到片段大小约为400 bp的目的条带，如图2（a）所示，与预期条带大小相符.进一步提取阳性克隆的质粒进行测序分析，结果表明2个目的靶点分别与OsU6SK 载体连接成功.然后将融合载体OsU6-SK-TG1、OsU6-SK-TG2、含有Cas9 的35S-Cas9-SK 空载体及pCAMBIA1300 双元载体分别酶切，分别回收带有靶点的sgRNA 片段、Cas9 片段及pCAMBIA1300 载体骨架进行连接，转化后获得重组载体.将重组载体进行酶切鉴定，结果显示切出了预期大小的目的片段，如图2（b）所示，表明带有靶点的sgRNA 和Cas9 成功连入了pCAMBIA1300 双元载体中，可以用于后续的转基因.

图2 OsDTH13 基因的CRISPR/Cas9 载体构建Fig.2 Construction of CRISPR/Cas9 vector for OsDTH13

2.3 转基因植株的获得和分子检测

重组载体构建成功后，通过农杆菌介导的遗传转化法，经愈伤组织的诱导、继代、农杆菌的侵染、抗性愈伤的筛选、分化、生根过程，最终获得了20 株水稻转基因植株.待转基因植株生长健壮后，单株提取基因组DNA，用载体中特异的潮霉素基因进行PCR 鉴定，结果如图3 所示，有13 株为转基因阳性植株.

图3 获得的CRISPR/Cas9 转基因植株的分子检测Fig.3 Molecular detection of the obtained CRISPR/Cas9 transgenic plants

2.4 突变体的编辑类型分析

为了明确水稻转基因植株中的目的基因是否被编辑，对获得的全部T0代转基因植株进行了突变位点分析，采用CTAB 法提取基因组DNA，然后用包含靶点的特异性检测引物进行PCR 扩增.扩增产物经测序分析，结果表明，13 株转基因植株中有5 株发生了基因编辑（#1～#5）.#1 编辑突变体是一个缺失的纯合突变体，在第一靶点PAM 序列-8 处缺失24个碱基，用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，发现其产物比野生型扩增产物小，如图4（a）所示.#2 是一个杂合缺失突变体，其中一条同源染色体在第一靶点PAM序列-4 处缺失了1个碱基，另一条同源染色体在第一靶点PAM 序列-4 处缺失了9个碱基，因此测序结果出现套峰，如图4（b）所示.#3 编辑突变体是一个纯合突变体，产生了碱基缺失和替换2 种突变形式，PCR检测结果表明，突变体扩增出的条带小于野生型，测序后发现与野生型相比，该突变体的2 条同源染色体在第一靶点PAM 序列-20 处发生碱基缺失，共缺失32 bp，在第二靶点PAM 序列-13 处由碱基C 替换为碱基G，如图4（c）所示.#4 编辑突变体是一个含有插入和缺失的双等位突变体，其中一条同源染色体在第一靶点PAM 序列-4 处缺失了1个碱基，另一条同源染色体序列在第一靶点PAM 序列-4 处插入了1个碱基，如图4（d）所示. #5 编辑突变体是一个单碱基插入的纯合突变体，在第二靶点PAM 序列-6 处插入了1个碱基，如图4（e）所示.

图4 编辑突变体的测序分析及PCR 鉴定Fig.4 Sequencing analysis and PCR identification of editing mutants

2.5 突变植株的氨基酸序列分析

OsDTH13 基因的编码序列长558 bp，编码的蛋白质含有186个氨基酸.利用DNAMAN 软件对3个纯合编辑突变体植株的氨基酸序列进行分析，发现与野生型植株相比，突变体所产生的突变导致了部分氨基酸缺失或蛋白质翻译提前终止，如图5 所示.

在氨基酸水平上，#1 突变体由于缺失24个碱基导致翻译后缺失了8个氨基酸（图5 中的#1-allele），并未造成移码.#3 突变体在第一靶点PAM 序列-20 处缺失32 bp，在第二靶点PAM 序列-13 处由碱基C 替换为碱基G，导致移码突变，从第10个氨基酸开始与野生型不同，并且终止于第19个氨基酸（图5 中的#3-allele），最终产生一个仅有19个氨基酸的截短的多肽.#5 突变体是一个单碱基插入的纯合突变体，插入造成移码突变，并提前终止于第30个氨基酸处（图5 中的#5-allele），产生一个30个氨基酸的截短的多肽.后续本课题组将利用这些突变体对OsDTH13 基因功能进行研究.

图5 野生型与3个突变体的氨基酸序列比对Fig.5 Comparison of amino acid sequences between wild type and three mutants

2.6 突变体植株的遗传模式分析

将上述T0代纯合编辑突变体获得的种子进行种植，得到T1代突变体植株.以#3 纯合突变体为例，对所得的T1代突变体植株提取DNA，用设计的检测引物进行PCR 扩增，扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测.结果显示，所有T1代植株均表现为纯合缺失突变，如图6 所示.经进一步的测序验证，测序结果与胶图相符，说明编辑突变体可以稳定遗传.

3 讨论与结论

植物中PEBP 基因家族成员的主要功能是控制植物开花时间和生长发育.现已明确了拟南芥和水稻中几个PEBP 基因对开花时间的调控作用.拟南芥中的FT 和TFL1 可以与14-3-3 蛋白及一个带有碱性亮氨酸拉链蛋白结构域的转录因子FD1 相互作用形成FAC 复合体（florigen activation complex），并随之结合在AP1 等一些开花基因启动子区域，从而诱导植物开花[4，15].水稻中的成花素基因为Hd3a 和RFT1，是拟南芥开花激活子FT 基因在水稻中的同源基因.水稻中2个成花素的作用机理与拟南芥中的成花素作用机理保守，成花素首先在细胞质中与受体14-3-3 互作，然后转移到细胞核中与FD1 互作形成FAC 复合体，促进下游OsMADS15 基因的表达，从而促进水稻的开花[15].Qin 等[16]在短柄草中鉴定出一个短日照特异表达的基因FTL9，FTL9 在短日照条件下促进开花，而在长日照条件下抑制开花.目前，在大豆中发现了10个FT 的同源基因，其中GmFT2a 和GmFT5a 已被证实为主要的开花促进因子，2个基因在不同光照条件下对开花的促进作用存在差异，在短日照条件下GmFT2a 的开花促进效应比GmFT5a 更强，而GmFT5a 在长日照条件下的开花促进效应更强[17].在进化过程中，FT 基因的功能逐渐出现分化，一些基因不仅仅调控植物开花.最近研究表明，水稻的成花素Hd3a 还可以负向调控水稻的抗病性，hd3a 突变体提高了水稻对白叶枯病菌的抗性[18].基于此，研究水稻中PEBP 家族不同成员的详细功能至关重要，对于全面理解该家族成员的功能具有重要意义.为揭示水稻中PEBP 家族成员的功能，本研究利用CRISPR-Cas9 技术创建了OsDTH13 基因的编辑突变体，最终得到了5 株突变体植株，其中2 株为单碱基插入，3 株为小片段的缺失.这些编辑突变体的获得为OsDTH13 的生物学功能研究奠定了基础. 后续本课题组将利用获得的能够稳定遗传的纯合突变体材料进行表型观察及基因功能研究，详细揭示该基因在水稻中的生物学功能.