加味身痛逐瘀汤调控Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨质疏松症的防治作用*

韩鹏勃，蒋 锋，刘 柱，姚亚波

1.西安医学院第二附属医院(西安 710038)；2.陕西省友谊医院(西安 710068)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变，多见于绝经后女性，主要表现为低骨量、骨微结构破坏，是导致骨脆性增加、强度降低，易发生骨折的全身性骨代谢疾病[1]。近年来，我国人口老龄化进程加速，OP发病率、致残率和死亡风险逐年增高，给社会和家庭带来沉重的经济负担[2]。因此，积极防治OP现已成为医疗关注的重点之一。中医药治疗在我国已有悠久的历史，具有辨证论治、防重于治、疗效佳、毒副作用小等优点，安全性及可行性较高[3]。据报道，加味身痛逐瘀汤在骨质疏松症的治疗中具有良好的临床疗效，可明显减轻患者症状[4-6]，但其在OP防治中的作用机制尚未见报道。现根据既往研究报道，骨代谢过程涉及信号传导通路、遗传基因及转录调控及激素等,其中经典Wnt/β-catenin信号传导通路在骨发育、骨形成及骨代谢等生理过程中发挥至关重要的作用[7]；Wnt通路可通过调节成骨细胞的增殖及分化进而增加骨量，诱导破骨细胞的凋亡[8]。且研究表明，Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白的表达与骨质疏松的发生及缓解密切相关，其异常表达会造成骨形成障碍，进而诱导骨质疏松症发生[9]。基于此，本研究通过建立去卵巢大鼠模型作为骨质疏松症研究对象，给予加味身痛逐瘀汤进行灌肠干预，通过观察其骨密度变化、股骨病理形态改变及股骨组织中 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达变化，探究加味身痛逐瘀汤对OP的防治作用机制，以期为OP的临床治疗提供理论基础和参考。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：选取60只成年健康雌性SD大鼠，SPF级，平均体质量(245±25) g，购自第四军医大学实验动物中心。

1.2 药物：加味身痛逐瘀处方组成，当归 、茯苓、川牛膝各20 g，秦艽、红花、川芎、桃仁、地龙各10 g，香附、羌活、五灵脂、苍术、杜仲、白芍各15 g，黄芪、续断、骨碎补各30 g，甘草5 g。所有药材均购自西安医学院第二附属医院，常规水煎。大鼠给药剂量换算方法参考《中药药理实验方法学》，大鼠等效剂量按照成人剂量的6.3倍计算，给药容积0.5 ml/100g，加味身痛逐瘀汤高、中、低剂量分别为 32、16、8 g /kg。

水合氯醛购自天津市光复精细化工研究所，戊酸雌二醇片购自拜耳医药保健有限公司广州分公司，青霉素购自华北制药股份有限公司，Wnt 、β-catenin和β-actin抗体购自Gene Tex，Wnt1和cyclin D1抗体购自 Abcam。

2 实验方法

2.1 模型的建立：采用摘除双侧卵巢法建立骨质疏松症大鼠动物模型。给予实验模型组大鼠40 g/L水合氯醛(3 μg/g体质量)，左侧腹腔肌肉注射麻醉，俯卧位固定，于腰背部脊柱两侧作纵行切口充分暴露卵巢组织，后结扎完整摘除两侧卵巢组织，缝合切口。假手术组同上暴露卵巢但不予以摘除，造模术后均给予青霉素防感染。

2.2 分组及给药：实验大鼠按体重随机分为6组，分别为假手术组，模型对照组，戊酸雌二醇组，加味身痛逐瘀汤高剂量组、中剂量组和低剂量组各10只。于造模成功后2个月给药，假手术组和模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃；戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片(0.09 μg/g 体质量)；加味身痛逐瘀汤高、中、低剂量组分别给予32、16、8 g/kg 体质量汤剂。各组均于上午 9:00 准时灌胃给药，1 d/1次，连续2个月。

2.3 取材：各组大鼠末次给药灌胃后禁食24 h，称重给予水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，取大鼠腹主动脉血液，离心取血清备用。处死各组动物，剥离肌肉、结缔组织，取大鼠左右侧股骨经生理盐水冲洗，锡纸包裹，-80 ℃冻存，以供后续检测。左侧股骨做 HE 染色，用于组织病理形态的观察，右侧股骨做Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表达的测定。

2.4 骨密度测定：采用美国NORLAND双能 X 线骨密度仪测量各组大鼠左右肢股骨骨密度，扫描速度70 mm/s，扫描宽度15 cm，以单位面积内骨矿物质含量(g /cm2) 表示，应用统计学软件分析数据。

2.5 股骨组织病理形态改变：取各组大鼠左股骨组织标本，多聚甲醛固定液固定，10% EDTA(pH 7.4)溶液脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋5 μm切片；60 ℃烤片，行股骨石蜡切片常规 HE染色，中性树胶封片，于倒置显微镜下观察各组大鼠骨组织病理形态，拍照记录。

2.6 股骨组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达测定：取各组大鼠右股骨组织标本，液氮研磨破碎，加入RIPA 裂解液提取总RNA，测定其浓度。取80 μg变性蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转移至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，加入一抗 Wnt(1∶1000)、Wnt1(1∶1000)、β-catenin(1∶2000)、cyclin D1(1∶5000)4℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，加入相应二抗，室温孵育 1 h， ECL显色，使用Azurec500化学发光成像系统拍照记录。使用 Image-J 图像分析软件分析各目标条带灰度值，以 β-actin 为内参，进行半定量结果分析。

结 果

1 各组大鼠骨密度检测结果对比 对比显示，模型对照组大鼠股骨骨密度值较假手术组明显降低(P<0.05)；与模型对照组相比，戊酸雌二醇组、加味身痛逐瘀汤高剂量组、中剂量组和低剂量组股骨骨密度值均显著升高(P<0.05)，但程度不一，戊酸雌二醇组升高较明显，加味身痛逐瘀汤高剂量组其次。见表1。

表1 各组大鼠骨密度值比较(g /cm2)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05

2 各组大鼠股骨组织病理形态对比 光镜下，假手术组大鼠骨小梁网状结构清晰、排列有序，基本结构正常；模型对照组大鼠骨小梁结构明显异常，表现为骨小梁断裂、不完整、网状结构消失；加味身痛逐瘀汤低、中剂量组骨小梁结构出现明显断裂。较模型对照组相比，戊酸雌二醇组和加味身痛逐瘀汤高剂量组骨小梁病理变化明显改善，骨小梁结构排列较规则有序，接近正常(图 1)。

图1 各组大鼠股骨组织病理形态(HE染色，×20)

3 各组大鼠股骨组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达对比 研究为明确各组大鼠股骨组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表达情况，故采用Western blot法对各组相关蛋白水平进行检测。见表2。模型对照组大鼠股骨组织中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表达含量较假手术组均显著降低(P<0.05)；戊酸雌二醇组、加味身痛逐瘀汤高、中、低剂量组股骨组织中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白表达含量均较模型对照组显著升高(P<0.05)，且加味身痛逐瘀汤高剂量组蛋白表达量升高最为显著(图2)。

表2 各组大鼠骨股组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达量

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05

注：1假手术组；2模型对照组；3戊酸雌二醇组；4加味身痛逐瘀汤高剂量组； 5加味身痛逐瘀汤中剂量组；6加味身痛逐瘀汤低剂量组

图2 各组大鼠股骨组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达

讨 论

OP是由多种因素引起的以低骨量、骨微结构改变为主要特征的常见骨代谢性疾病，一般分为原发性和继发性两大类，多见于绝经后女性和老年男性，其导致的骨强度减弱、易骨折等严重影响中老年人群的生活质量，现已受到医学界重视，并将其列为三大老年病之一[10]。资料显示[11-13]，骨代谢过程中骨形成和骨代谢偶联失衡，致使骨密度降低是OP的基本发病机制；且认为OP与机体内分泌紊乱、降钙素缺失及甲状腺激素、生长激素和糖皮质激素等分泌异常密切相关。目前，临床采用有效的药物治疗如雌激素代替疗法、选择性雌激素受体调节剂、降钙素及抑制骨吸收药和促进骨形成药等阻止、治疗OP，患者病情暂时得到缓解，但普遍存在依从性差、药物过敏等副作用，多数患者仍遭受病痛的折磨[14]。近年来，中医药在OP治疗临床和实验中取得了较好成效，其辨证论治、防重于治，在提高疗效的同时药物毒副作用小，且具有较高安全性及可行性。因此，探寻有效的OP中医药方剂及机制，具有重要的临床价值和社会意义。

中医理论认为，根据临床特征及发病特点可将OP归属于“骨枯”、“骨痹”、“骨痿”等范畴，并认为肾精亏虚是OP的主要病因[15]。据《医经精义》记载：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之合也”。脾肾亏虚为本，血瘀为要，“虚”、“瘀”相互影响、互为因果。脾肾两虚导致整体机能减退，气不能行血，出现瘀阻脉络，“不通则痛”，故临床上OP患者大多以腰背疼痛就诊。而脉络瘀阻，精微气血不畅，导致脾肾亏虚，骨失所养，生髓乏源，进而加速OP发生。因此，临床上对OP的治疗主要以活血化瘀、补肾强骨为原则，且临床试验表明，补肾中药可增强骨细胞活性，调节机体内环境平衡，促进骨中矿物质沉积，进而阻抗OP发生。加味身痛逐瘀汤为王清任创制的名方[16]，方中川芎、桃仁、当归、红花等活血化瘀，可降低血液黏稠度，改善血管微循环和通透性，促进修复及再生；五灵脂、香附等活血行气，疏肝解郁，抗炎，散瘀止痛；羌活、秦艽等解热镇痛，祛风湿，舒经脉；川牛膝、杜仲等活血通经，补益肝肾，强筋骨；地龙舒筋利血脉，黄芪补中益气，茯苓利水消肿；甘草调和诸药，共为佐使，同时配以续断、骨碎补活血续筋、补肾强骨。全方共奏活血化瘀、通痹止痛、补肾之功效。袁菱梅等研究发现[4]，电针结合加味身痛逐瘀汤，可明显缓解原发性骨质疏松症的症状，提高患者的生活质量。陈鲁峰等[6]在老年骨质疏松性椎体压缩性骨折的临床中药治疗中发现加味身痛逐瘀汤能明显改善临床疗效，提高患者骨密度。此外，现代药理研究表明[17]，方中骨碎补能提高碱性磷酸酶活性，抑制破骨细胞骨吸收，促进成骨细胞增殖，利于骨盐和骨钙化的形成，增加骨密度。同时中药能够调控骨生长因子，提高骨磷、骨钙、骨胶原含量，通过增加骨密度进而改善骨生物力学性能，利于骨折愈合[18]。因此本课题通过切除大鼠双侧卵巢构建骨质疏松大鼠模型，研究加味身痛逐瘀汤对骨质疏松症的治疗效果，结果显示，去卵巢后大鼠BMD 下降，骨微结构遭到严重破坏呈现出明显的 OP 症状，表明去除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松症模型成功。而加味身痛逐瘀汤干预去卵巢大鼠 4 周后，能明显升高其骨密度，抑制骨微结构的破坏，表明加味身痛逐瘀汤对骨质疏松症具有一定的治疗效果，戊酸雌二醇组和高剂量加味身痛逐瘀汤的防治效果最佳，但临床上患者可能对西药过敏及其他副作用导致效果不佳，而加味身痛逐瘀汤能有效缓解骨质疏松症，且因其没有药物副作用，在临床上可广泛应用。

据国内外大量文献报道，成骨细胞及破骨细胞的增殖分化受Wnt/β-catenin 信号通路调控，在OP中发挥重要作用。近年来，有关骨代谢的研究中Wnt/β-catenin通路较为深入，认为该通路在骨代谢过程中发挥关键作用。韩学明等[19]研究发现，绝经后骨质疏松症患者体内β-catenin的表达量明显低于正常老年女性，表明Wnt/β-catenin通路可能参与了疾病的发生发展过程。沈霖等[20]利用具有补肾滋阴功效的青蛾丸治疗 80 例绝经后骨质疏松患者，发现青娥丸能够维持绝经后骨质疏松患者的骨密度，其部分疗效机制与其可增强患者β-catenin表达和抑制DKK-1水平有关。成鹏等[21]在去卵巢大鼠的OP症中研究发现，黄芪甲苷能够有效缓解氧化应激介导的OP，可能与其调控Wnt2/β-catenin 通路，降低骨代谢水平，减少骨吸收作用相关。Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1等蛋白是调控 Wnt/β-catenin 信号通路的关键因子，其高表达表明Wnt/β-catenin 信号通路的激活。本研究测定了大鼠股骨组织中Wnt、Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白的表达水平，结果发现，加味身痛逐瘀汤干预去卵巢大鼠后促进了Wnt/β-catenin信号通路的活性，由此可以推断加味身痛逐瘀汤可能通过正向调控 Wnt/β -catenin 信号通路，提高骨密度，改善骨组织形态，对骨质疏松症具有治疗效果。