盐肤木总酚酸微丸对大鼠急性心肌缺血的保护作用

林亚娟，徐 伟，叶 淼，褚克丹，卢晓艺，连 红，王晓颖

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病，coronary heart disease，CHD)是一种较为常见的心血管疾病，它的一个重要标志是动脉粥样硬化斑块。斑块会随时间的推移使冠状动脉发生慢性狭窄、痉挛或阻塞，从而导致心肌缺血、缺氧或梗死而引发心脏病[1-4]。近年来，中医中药对心肌缺血保护作用的研究日趋增多，人们应用中药预防和治疗心肌缺血损伤取得了较好的效果，研发的中药制剂不断增多[5-6]。舒冠通糖浆是应用漆树科盐肤木(RhusChinensisMill.,YFM)的干燥根茎经水提醇沉后制成的单味药糖浆剂，具有理气行血、活血化瘀等功效，临床上主要用于冠心病、心绞痛的治疗，其疗效确切。课题组前期基于YFM对斑马鱼冠心病模型的筛选，证实YFM抗冠心病的有效部位为总酚酸。同时，课题组前期将舒冠通糖浆进行剂型的二次开发，改良为YFM总酚酸微丸。有研究表明，YFM对垂体后叶素(pituitrin，pit)引起的大鼠急性心肌缺血具有保护作用[7-8]。本研究在前期课题组的研究背景下，建立舌下静脉注射pit致大鼠急性心肌缺血模型，采用预防灌胃给药，探讨YFM总酚酸微丸对急性心肌缺血的预防性保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 雄性SPF级SD大鼠，体质量(250±20)g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002]。

1.1.2试药 地奥心血康胶囊(批号：1801051，规格：100 mg，成都地奥制药集团有限公司)；硝苯地平(批号：20180304，规格：10 mg，华中药业股份有限公司)；本实验用YFM粗提物(YFM粗提物：YFM块茎以70%乙醇提取后取澄清滤液为YFM粗提物，1.84 g/mL)、YFM总酚酸(YFM总酚酸：YFM块茎以70%乙醇提取后取澄清滤液经大孔树脂纯化得到，39 g/mL)[9]和YFM提取物微丸(YFM微丸，自制，载药量：28.7%，136 g/mL，批号：20181027)[10]与YFM生药量对等关系相同；pit注射液(pit，规格：6 U：2 mL，批号：1704201，上海上药第一生化药业有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(96T)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)试剂盒(50T)(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3仪器 生物机能实验系统(BL-420A，成都泰盟软件有限公司)，电子分析天平(XS105，梅特勒-托利多仪器有限公司)，台式冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)，离心机(5418-Eppendorf，德国艾本德股份有限公司)，数显恒温水浴锅(HH-4，常州国华电器有限公司)，旋涡混合振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，多功能酶标仪(奥地利Infinite公司)，紫外分光光度计(UV-1800，日本岛津公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组与造模 SD大鼠适应性喂养5 d，10%水合氯醛麻醉，测定大鼠心电图，筛选出56只肢体Ⅱ导联心电图正常(麻醉后S点不高于基线)的大鼠，将筛选出的大鼠随机分为7组：对照组、模型组、地奥心血康胶囊组(0.061 3 g/kg)、硝苯地平组(6.13 mg/kg)、YFM粗提物组(9.2 g/kg)、YFM总酚酸组(0.195 g/kg)、YFM微丸组(0.68 g/kg)，每组8只。其中，YFM粗提物、YFM总酚酸和YFM微丸用量根据YFM生药量进行换算，舒冠通糖浆每日服用量为30 mL，相当于45 g YFM生药材。YFM生药材经提取、纯化后，按人的常用剂量的等效剂量计算，YFM粗提物和YFM总酚酸分别为0.75 g/kg和16 mg/kg，折算成大鼠给药剂量分别为4.6 g/kg和98.08 mg/kg；YFM微丸的载药量(即含YFM总酚酸的量)为28.7%，则YFM微丸的给药剂量为342 mg/kg，根据预试验结果，最终选择给药剂量的两倍量即0.68 g/kg作为YFM微丸的研究剂量，相对应的YFM粗提物的剂量为9.2 g/kg，YFM总酚酸的剂量为0.195 g/kg。对照组和模型组灌胃给水10 d，其余连续灌胃给药10 d；给药(水)体积为5 mL/kg。最后一次给药2 h后，采用舌下静脉注射pit 1 U/kg的方法建立急性心肌缺血模型，用BL-420 A生物机能实验系统记录Ⅱ导联心电图。舌下静脉注射pit引起大鼠心肌缺血时，通过观察心电图ST段的变化通常可分为两期，第一期注射后5～30 s T波升高，ST段抬高(>0.1 mV)；第二期注射后30 s至数分钟，ST段下移，T波降低、平坦、双向或倒置，心率减慢，P-R及Q-T间期延长。出现第一期或第二期缺血性变化为阳性，否则为阴性[6]。本研究模型组注射pit后30 s前ST段抬高超过0.1 mV，30 s后ST段下移，T波低平或者倒置，与文献报道一致，说明造模成功。

1.2.2指标检测

1.2.2.1心肌缺血大鼠心电图变化的测定 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定在手术台板上，四肢皮下插入注射用针头，用鳄鱼夹将针头连接肢导联，记录大鼠肢体Ⅱ导联心电图；以PP连线为基线，记录注射pit前及注射完pit后0，5，10，15，30，60，300，600 s的心电图ST段值，并分析各组注射pit 前后ST段变化。观察并记录心电图中室性心律失常发生率及心肌缺血阳性率。当心电图出现宽大或畸形的QRS波、无P波或P波倒置逆反、心律不齐等一项者记为心律失常。当出现下列指征一项者即为心肌缺血性阳性：J点升高1.5 mV以上，T波降低50%以上，双向、倒置，ST段抬高0.1 mV或压低0.5 mV，心率不齐。观察并记录舌下静脉注射pit前后ST段的波动情况及心率的改变。

1.2.2.2心肌缺血大鼠血清生化指标的检测 测定心电图后，大鼠腹主动脉取血5 mL，室温放置2 h，离心10 min(3 500 r/min)，小心移取血清置EP管中，-80 ℃保存备用。测定时取出血清，快速解冻，严格按照试剂盒步骤进行操作，测定血清中LDH和CK的活性[11]。

2 结 果

2.1心肌缺血大鼠心电图ST段变化 模型组大鼠注射pit后的前30 s ST段明显抬高，ST段值抬高超过0.1 mV，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功，造模后通过实时监测得到各组大鼠典型心电图见图1。通过统计分析可见，舌下静脉注射pit进行造模前各组ST段比较，差别无统计学意义，说明灌胃给药对正常大鼠的心电图无影响。观察注射pit后5，10及15 s的心电图发现，各给药组的ST段虽有抬高，但与模型组比较，第一期ST段抬高的幅度有所降低，其ST段抬高值均<0.1 mV；与模型组比较(除YFM粗提物)，差别均有统计学意义(P<0.05或0.01)。从表1可见，YFM粗提物组、YFM总酚酸组及YFM微丸组的ST段最大变化量分别为0.080，0.062，0.059 mV，数值显示ST段最大变化量：YFM微丸组

2.2心肌缺血大鼠心率变化 舌下静脉注射pit后，各组(对照组除外)大鼠的心率在10 min内均随着时间的延长而逐步减慢，模型组在各时间点的心率减慢尤为显著，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)；各给药组心率虽有减慢，但与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。注射pit 5 s时，模型组心率降低幅度较大，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)；10 s时各给药组(除YFM粗提物)心率均有所下降，但其下降的幅度小于模型组，心率显著高于模型组(P<0.05或0.01)；600 s时，对照组、地奥心血康胶囊组、硝苯地平组和YFM微丸组心率显著高于模型组(P<0.01)，且YFM微丸组与地奥心血康胶囊组和硝苯地平组比较，差别无统计学意义(P>0.05)，YFM粗提物组与YFM微丸组配对t检验显示，差别有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1 急性心肌缺血大鼠心电图ST段变化测定结果

2.3心肌缺血大鼠血清生化指标结果 与对照组比较，舌下静脉注射pit模型组大鼠血清中LDH和CK的活性水平升高较为明显，差别具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，各给药组血清中LDH和CK的活性水平均有所降低，差别具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；YFM各组与阳性对照药地奥心血康胶囊和硝苯地平组比较，差别无统计学意义(P>0.01)。YFM各组间配对比较，YFM总酚酸组LDH活性显著低于YFM粗提物组(P<0.05)(表3)。

表2 急性心肌缺血大鼠心率测定结果

表3 注射pit致急性心肌缺血大鼠血清生化指标测定结果

Tab 3 The detection results of serum biochemical index of acute myocardial ischemia in rats induced by sublingual injection of pituitrin

分 组ρLDH/(U·L-1)ρCK/(U·mL-1)对照组6 061.20±1 449.26▲2.61±0.32▲模型组10 198.44±2 116.009.08±1.44地奥心血康胶囊组7 967.80±728.96▲3.62±1.07▲硝苯地平组7 065.94±2 622.75▲3.30±1.09▲YFM粗提物组8 636.20±771.58△3.40±0.76▲YFM总酚酸组7 671.01±955.80▲4.30±1.03▲YFM微丸组7 897.97±936.90▲4.45±1.16▲

3 讨 论

舌下静脉的毛细血管较为丰富，采用舌下静脉注射大剂量pit可迅速由毛细血管吸收，从而使冠状动脉血管腔发生痉挛，引起心脏供血不足，同时造成全身小血管的强烈收缩，导致血压升高，心脏后负荷加重，最终引发急性心肌缺血缺氧[12]，因此给大鼠舌下静脉注射pit后，可通过观察各个时间点的心电图变化，记录急性心肌缺血较为典型的变化。注射pit导致的急性心肌缺血损伤具有渐进性，和人体急性心肌缺血损伤具有较高的相似度，其心电图变化和人体心电图基本一致，并且该方法灵敏度高、操作简便，实验周期短，可通过直接实时监测心电图的变化情况大致判断结果，被广泛用于抗心肌缺血缺氧药物的筛选[5]。文献报道，YFM的水提液对注射pit引起的急性心肌缺血缺氧的大鼠具有一定的保护作用[7-8]，因此，本研究采用该模型探讨YFM总酚酸及其微丸对急性心肌缺血的保护作用。

YFM微丸为舒冠通糖浆的二次开发产品，舒冠通糖浆在临床上主要用于冠心病、心绞痛的治疗，为中成药。本研究同时选择治疗急性心肌缺血的西药硝苯地平和与YFM微丸功能主治相近的中成药地奥心血康胶囊为阳性对照药，对YFM微丸进行急性心肌缺血的药效学研究，以便更好地衡量YFM微丸的抗急性心肌缺血效果。结果显示，在心肌缺血大鼠心电图ST段变化和心率变化以及降低LDH活性等方面，YFM微丸的抗急性心肌缺血方面的研究结果显示，其效果更接近于地奥心血康胶囊组。

心肌缺血性损伤的范围和程度可直接通过观察心电图ST段的改变得知。本研究通过舌下静脉注射pit造成大鼠急性心肌缺血，对YFM提取物及其微丸进行药效学评价，大鼠肢体Ⅱ导联心电图表明，YFM总酚酸和YFM总酚酸微丸能够显著抑制pit引起的ST段的变化，抑制ST段第一期的抬高和第二期的降低，同时可降低大鼠心律失常的发生率和心率的改变。本研究结果表明：YFM总酚酸和YFM总酚酸微丸对急性心肌缺血的大鼠具有明显的保护作用，而YFM粗提物对于减轻pit致急性心肌缺血的作用也有一定的作用，但其作用弱于前两者，这可能是YFM提取物经过大孔树脂纯化后，大部分杂质被除去，有效成分被富集，使其含量提高，因此增强了对pit致急性心肌缺血的保护作用。另外YFM总酚酸微丸对pit致急性心肌缺血的保护作用比YFM总酚酸略为明显，可能是YFM总酚酸制成微丸后剂型的改变能够促进有效成分在体内的吸收。

LDH和CK是评价心肌损伤的重要指标。急性心肌缺血缺氧使心肌细胞膜受到损伤，进而产生大量的氧自由基，使LDH和CK被大量释放入血，导致血清中的LDH及CK水平显著升高[13-14]。本研究结果表明，YFM总酚酸及其微丸能显著降低pit诱导急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH和CK的活性，提示YFM总酚酸微丸对心肌细胞的细胞膜具有保护作用，从而减少LDH及CK的漏出。

综上所述，YFM总酚酸及其微丸可抑制pit致大鼠心肌缺血心电图ST段的抬高和改善T波的变化，对心肌缺血和心律失常情况均有所改善，能显著降低pit致大鼠心肌缺血血清中CK和LDH的量，说明YFM总酚酸及其微丸有明显的抗心肌缺血的保护作用。本研究为YFM总酚酸微丸的进一步开发提供了实验支持，但YFM总酚酸微丸发挥心肌保护作用的机制尚未明确，有待课题组进一步研究。