全自动染色机在骨髓组织脱钙中的改造应用

翁丹枫，黎三艳，唐坚清，陈余朋，李国平，张 声

骨髓组织富含钙盐，故制片前需要脱钙处理，脱钙不全或脱钙过度均可影响骨髓组织切片的H-E染色或免疫组织化学染色效果，降低病理诊断的准确率。笔者前期配制了一种适合骨髓组织脱钙的改良EDTA脱钙液，可在24 h内使骨髓组织脱钙完全，有利于提高骨髓疾病诊断的准确性[1]。为提高工作效率，同时避免人工操作误差，使脱钙过程稳定，本研究尝试将MYR SS-30全自动染色机改造应用于骨髓组织的EDTA脱钙处理中，并探讨最佳的EDTA脱钙程序和脱钙时间，以便使后期临床工作流程标准化、规范化。

1 临床资料

1.1一般资料 选取2017年11月-2018年3月由病理科接收的不同部位恶性骨肿瘤标本30例，男性19例，女性11例，年龄(28±9)岁(6～47岁)。骨肿瘤部位：股骨21例，肱骨6例，胫骨3例。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 全自动染色机(MYR SS-30，广州维格斯公司)；脱水机(Pathcenter，美国Thermo公司)；多功能染色机(ST5020，德国Leica公司)；全自动免疫组织化学染色机(Autostainer Link 48，丹麦Dako公司)。40%甲醛(上海东懿化学试剂有限公司)；10%中性福尔马林固定液；改良EDTA脱钙液。

1.2.2配制改良EDTA脱钙液(pH为7.0) 取250 g的EDTA-2Na，溶于1 350 mL磷酸盐缓冲液中(0.01 mol/L，pH为7.2～7.4)，待溶液彻底溶解后加入40%甲醛150 mL，加入氢氧化钠调节溶液pH值至7.0[1]。

1.2.3脱钙处理 每例骨肿瘤标本均用直径为0.2 cm的骨髓穿刺针在松质骨部位穿刺长1 cm的骨髓组织5条，随机各取1条骨髓组织放入已做好分组标记的包埋盒中：A组为手工EDTA脱钙组，室温下脱钙时间为24 h；B组为全自动染色机EDTA脱钙组，室温下脱钙时间分别为16，18，20及22 h。

1.2.4脱钙机(改造后的全自动染色机)操作步骤 先将穿刺好的骨髓组织块放入配套的改造的染色架(图1)，再放入染色机的进口位，染色机试剂缸位如图2所示，根据不同脱钙时间选择相应脱钙程序(表1)，脱钙结束后，染色机发出提示音提醒，即可直接上机进入脱水程序。

1.2.5H-E染色及免疫组织化学染色 切片行常规H-E染色，免疫组织化学染色采用EnVision两步法。由两名高级职称病理医师阅片判定H-E染色及免疫组织化学染色效果。

表1 MYR SS-30染色机脱钙程序(16 h)

Tab 1 Decalcification procedure of MYR SS-30 staining machine (16 h)

步骤缸位试剂时间(min∶s)抖动(s)上下震荡(次)11,210%中性福尔马林(装载)30∶00(×2)1(×2)10(×2)23,4蒸馏水30∶00(×2)1(×2)10(×2)35EDTA59∶59110410空白缸00∶010055,6EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)610空白缸00∶010076,7EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)810空白缸00∶010097,8EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1010空白缸00∶0100118,9EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1210空白缸00∶0100139,11EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1410空白缸00∶01001511,12EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1610空白缸00∶01001712,13EDTA59∶59(×2)1(×2)10(×2)1810空白缸00∶01001913EDTA59∶591102014蒸馏水15∶001102115,1670%酒精(卸载)00∶0100

1.3统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1H-E染色结果 EDTA手工脱钙和全自动染色机EDTA脱钙液脱钙骨髓组织形态完整，胞核和胞质层次分明，染色均匀，色质鲜艳，对比度好(图3)；全自动染色机EDTA脱钙，16 h组28例H-E染色效果佳，而18，20及22 h组30例H-E染色效果均佳，与手工EDTA脱钙H-E染色效果差别无统计学意义(P>0.05)。

2.2免疫组织化学染色结果 经手工EDTA脱钙及全自动染色机EDTA脱钙骨髓组织免疫组织化学染色阳性定位准确(图4)；经手工EDTA脱钙与全自动染色机EDTA脱钙时间分别为16，18，20及22 h骨髓组织相比，Kappa，Ki-67，Lambda和MPO 4个抗体表达阳性率差别均无统计学意义(P>0.05，表2)；经全自动染色机EDTA不同脱钙时间骨髓组织在上述指标免疫组织化学表达差别无统计学意义(P>0.05，表3)。

表2 不同脱钙处理骨髓免疫组织化学染色

Tab 2 Immunohistochemical expression under different decalcification procedures

染色机EDTA脱钙(16 h)手工EDTA脱钙高表达低表达Kappa 高表达254 低表达10Ki-67 高表达253 低表达11Lambda 高表达251 低表达04MPO 高表达271 低表达02

表3 改造染色机EDTA不同脱钙时间免疫组织化学表达

Tab 3 Immunohistochemical expression under EDTA decalcification with different time via modified staining machine

t脱钙/hKappa高表达低表达Ki-67高表达低表达Lambda高表达低表达MPO高表达低表达16264273246282182912822642822030027327328222291273273291

3 讨 论

骨肿瘤的骨髓组织中含有大量的钙盐，脱钙是应用化学或物理的方法将骨组织成分中的钙盐与胶原纤维分离后弃去钙盐，保留完整的胶质纤维成分[2]。EDTA是一种优良的脱钙剂，对骨组织的形态结构和抗原性破坏较小。因此，常用于需要脱钙的免疫组织化学染色[3]。EDTA脱钙液在4%～16%浓度中以10%和13%浓度的脱钙效果最好，在20 ℃条件下，骨松质需要3～3.5 d脱钙完成。本实验选用浓度为13%的EDTA，手工操作脱钙时间为24 h，但实际工作中经常遇到没有及时中止脱钙而造成病理诊断周期延长，增加了患者的等待时间，不能很好地满足临床诊疗需要。而经改造的全自动染色机脱钙的骨髓组织最短16 h可脱钙完成，且高效、稳定，保证了骨髓标本脱钙处理的规范化。

本研究将全自动染色机应用于EDTA骨髓组织脱钙前进行了如下改造：(1)将染色机配套染色架相邻两个片槽之间的间隔锯掉，使之能够装载组织包埋盒，改造后的架子可同时装载10个包埋盒；(2)将染色机入水口和排水口封闭改造成缸位，改造后有16个缸位可全部用于放置脱钙所需液缸；(3)机子共有8个缸位放置EDTA脱钙液，每缸限定的最长停留时间为59 min 59 s，组织在所有脱钙液缸中走完一遍仅8 h，又因脱钙程序只能从起点到终点按顺序而不能逆向运行。因此，笔者在10号站点设置一个空缸，组织在每缸EDTA脱钙液中停留时间达59 min 59 s后到空缸，停留1 s后回到原来的脱钙液缸位继续脱钙，从而使可运行的脱钙时间加倍。

改造后的全自动染色机用于脱钙的优点：(1)缩短脱钙时间，脱钙过程中组织随染色架的上下震荡加速脱钙液渗入组织，脱钙时间缩短至16 h，比传统手工法快8 h；(2)增加可脱钙时长：空缸的设置使可运行的脱钙时间加倍；(3)防止脱钙过度：脱钙完成后的报警装置能够提醒操作人员及时进行后续处理；(4)标本处理量增多：改造后的染色机可同时运行5个不同的脱钙程序，最多可同时处理50个组织标本；(5)减少环境污染：全自动染色机脱钙流程均在密闭的空间内进行，且配置了活性碳过滤系统，极大减少了化学试剂的环境污染和挥发性刺激，为技术员提供一个安全、健康、环保的工作环境；(6)配有备用电池：可以防止运行过程中出现断电现象。

全自动染色机改造应用于EDTA骨髓组织脱钙时应注意：(1)多个脱钙程序同时运行时，前一个程序运行到第三缸的时候，后一个程序才可以开始运行，否则易导致染色机无法区分不同程序；(2)当脱钙达到200个蜡块左右时更换EDTA脱钙液，优先更换5～9号缸脱钙液，11～13号缸脱钙液按顺序前移，以保证脱钙液纯度的同时最大程度节约试剂；(3)当有≥3个的程序同时运行时，应在脱钙结束后尽快卸载取走组织直接进入脱水模式，以免影响后续程序的运行。

综上所述，将全自动染色机改造应用于EDTA骨髓组织脱钙操作简单，脱钙时间短，组织的形态学结构和抗原活性完整保留，能够满足临床快速诊疗的需要。应用改造染色机脱钙实现了机器取代人工操作的线性规范化流程，节省人力，且由于始终在封闭的环境中运行，有效减少有毒化学试剂吸入的危害，有利于环保，值得在骨髓活检组织等标本处理过程中推广应用。