基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

曹兴林　恽君雯　陈丽　宋伟　　侯继波　冯磊　徐业芬

摘要：为了建立高品质的犬肾（MDCK）单克隆细胞系，使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除，构建细胞培养禽流感病毒（AIV）增殖体系。首先，根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后，用3种载体共转染MDCK细胞，通过GFP阳性特征分选单细胞克隆，单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序，确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系，与原始细胞相比，该细胞系的病毒增殖能力提高。

关键词：CRISPR/Cas9;犬肾（MDCK）细胞;IFN-β1;禽流感病毒（AIV）;增毒能力

中图分类号： S852.65+7文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）07-0059-06

禽流感（AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽类烈性传染病，由于其血清型多，易发生变异[1-3]，给国际养禽业造成了巨大的经济损失，而且在人类公共卫生上也造成重大影响[4-7]，从而引起了研究人员的高度关注。犬肾（MDCK）细胞是目前用于禽流感病毒增殖主要的宿主细胞[8-9]。有研究表明，当禽流感病毒在MDCK细胞中的连续传代时，其增殖效率呈现出逐渐下降的趋势。甚至在连续增殖到某一代次时，禽流感病毒的增殖效率会出现断崖式下降。造成这一情况的原因目前尚不明确，但与子代病毒粒子中缺陷型病毒粒子占比的逐渐增加有关。而这种缺陷型病毒粒子的生成又与宿主细胞Ⅰ型干扰素介导的宿主细胞天然免疫拮抗病毒增殖有关。有关文献表明，IFN-β1在禽流感病毒感染MDCK细胞的过程中可以诱发细胞产生天然免疫拮抗病毒增殖的信号通路，在病毒吸附、转运、逆转录、复制以及芽殖等多个过程对病毒的增殖进行干扰。同时释放到胞外的IFN-β1可通过细胞膜上的干扰素识别受体[10-11]，激活未被禽流感病毒感染的正常细胞的天然免疫系统，使得禽流感病毒在细胞间的传播受到抑制。

CRISPR是细菌和古细菌用来对抗入侵病毒及外源 DNA 的免疫防御系统。因其机构为成簇规律性间隔短回文重复序列，被命名为CRISPR[12]。目前CRISPR/Cas9已经成为第三代基因编辑手段，较传统基因编辑工具锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）而言，CRISPR/Cas9操作简便、突变率高[13-15]。CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功应用于各种体外和体内基因敲除模型的建立，成为重要的基因工程技术手段[16-18]。

综上所述，通过基因工程手段敲除MDCK细胞的干扰素IFN-β1基因编码片段，去除细胞的主要天然免疫信号传递分子，为提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率提供新思路和新种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 MDCK细胞购自ATCC-CCL34、AIV-H9亚型病毒：A/chicken/Jiangsu/02/09（简称JS02），由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离、保藏;pCMV-MCS-IRES-eGFP、pUC-sgRNA-cloning载体由国家兽用生物制品工程技术研究中心实验室构建提供。

1.1.2 试剂 DNA连接酶Solution Ⅰ、NheⅠ、XhoⅠ购于Takara Bio有限公司;限制性内切酶BbsⅠ-HF购于NEB Labs;质粒DNA提试剂盒，转染试剂购于QIAGEN公司;FBS血清购于Thermoscientific;DMEM培养基来自本研究所;琼脂粉Ager购于Biofroxx公司 ;氨苄，薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于RENERAY Biochnology。

1.1.3 仪器梯度 PCR仪，Biometra公司;核酸电泳仪，全自动凝胶成像分析系统，上海天能公司;超微量紫外分光光度计，Nano Drop one;CO2细胞培养箱Thermo scientific;水浴锅，低速离心机离心机，北京鼎昊源科技有限公司;高速离心机，Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA引物的设计及构建分析 犬IFN-β1的基因序列（Gene ID：481558），根据Cas9蛋白识别序列要求，并考虑序列的特异性以及可能的编辑脱靶效率，选取GCTCATGGCAAGAGCCATGGTGG为靶序列1，GATAATCTGTAAGTATATTAAGG为靶序列2。针对这2条靶序列，设计2对DNA oligo引物用于sgRNA表达载体的构建，序列如下：sgRNA-1-F：5′-[JP9]CACCGGCTCATGGCAAGAGCCATGG-3′;sgRNA-1-R：5′-[JP9]AAACGCCATGGCTCTTGCCATGAGC-3′;sgRNA-2-F：5′-[JP9]CACCGGATAATCTGTAAGTATATTA-3′;sgRNA-2-R：5′-[JP9]AAACGTAATATACTTACAGATTATC-3′。2对靶序列引物分別经退火处理，连接至经BbsⅠ（购自NEB）处理的pUC-sgRNA-cloning载体，获得pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2，用于后续转染试验。

1.2.2 pCas9-IRES-eGFP载体的构建 根据犬的蛋白质翻译密码子偏好性，优化Cas9蛋白编码序列，并在该序列2端各加入1条SV40病毒的NLS序列。化学合成该序列（南京金斯瑞生物科技有限公司），用于载体构建。PCR扩增Cas9片段（引物-F：5′-[JP9]GGGCTAGCATGGCCCCAAAGAAGAAG-3′;引物-R：5′-[JP9]GGCTCGAGCCCCAACCCCG-3′），产物经NheⅠ和XhoⅠ处理。

1.2.3 细胞的转染和分选 根据转染试剂（Qiagen）的配制及使用说明，配制含有1.0 μg pCas9-IRES-GFP，各0.5 μg pUC-sgRNA1和pUC-sgRNA2的转染复合物，经转染MDCK细胞后24 h，于荧光显微镜下观察转染情况，对照细胞无绿色荧光，转染细胞若转染成功，即呈现绿色。转染后48 h内对转染阳性细胞进行FACS细胞分选，将阳性细胞单克隆分选至含有10% FBS血清的MDCK细胞培养基中，设置每孔单个细胞克隆。置于正常培养环境下继续培养1周待用。

1.2.4 单克隆细胞鉴定 待单细胞克隆恢复生长，制作细胞克隆复板，用于细胞克隆的继续培养以及细胞克隆的基因组DNA的提取鉴定。针对犬IFN-β1基因序列合成PCR扩增引物F：5′-[JP9]ATGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGG-3′和R：5′-[JP9]GTCAAGCATCGTCCATTCCGAGAG-3′。经PCR扩增（98 ℃，30 s;98 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环;72 ℃10 min）。鉴定单克隆MDCK细胞的扩增片段，经PCR产物测序结果，确定基因敲除的细胞克隆。

1.2.5 H9亚型禽流感病毒的增殖及血凝效价的测定

1.2.5.1 H9亚型禽流感病毒的增殖 MDCK母细胞、细胞克隆接种于6孔板中，待汇合度达到95%，以1%的接毒量加入H9亚型禽流感病毒JS02株，同时添加8 μg/mL的TPCK处理的胰蛋白酶用于病毒增殖，接毒3 d后反复冻融培养物，测定子代病毒HA效价。并按照上述接毒操作进行病毒的连续传代，分别于不同代次测定病毒HA效价。

1.2.5.2 H9亚型病毒HA效价的检测 采新鲜SPF公鸡血，经抗凝处理，以PBS清洗血球3次，配制成1%鸡血球PBS液。在HA检测96孔板上用定量稀释器于每排各孔中加PBS 25 μL。以稀释器吸取25 μL待测样品于第一孔中，连续对倍稀释该样品至第11孔，弃去25 μL，第12孔不加样品作为对照。每孔中补加25 μL PBS，然后每孔分别加入25 μL 1%鸡血球PBS液，在振板器上振动20 s，室温下作用30～40 min。作用结束后依据血球凝集程度判定反应结果，以出现完全凝集的最大稀释度为该样品的血球凝集效价，以log2/25 μL来表示。

2 结果与分析

2.1 pCas9-IRES-eGFP载体构建

Cas9编码序列的PCR产物核酸电泳结果如图1-A所示，pCas9-IRES-eGFP载体经NheⅠ和XhoⅠ双酶切处理，产生4 227 bp和5 714 bp的2条片段，电泳结果如图1-B所示，结果正确，pCas9-IRES-eGFP载体用于转染试验。

2.2 细胞转染结果

瞬时转染CRISPR/Cas9系统的3质粒进入MDCK细胞24 h后，于荧光显微镜下观察转染结果（图2）。结果显示，阴性对照MDCK细胞无绿色荧光，转染后MDCK细胞呈现绿色荧光，图2-B箭头所指荧光代表转染成功的MDCK细胞。

2.3 细胞流式分选

转染48 h内，以BD FACSDiva 8.0.1流式细胞仪进行细胞分选（图3），绿色荧光表达强度最高（Top 1%～2%）的阳性MDCK细胞被分选至96孔板，形成单细胞克隆。

2.4 目标序列的PCR扩增及产物测序比对

待96孔板中单细胞克隆生长恢复，达到85%的生长汇合度，进行细胞复板操作。将复板后细胞克隆分别进行基因组DNA抽提及目标片段的PCR扩增，结果如图4所示。对照细胞的扩增片段大小为767 bp，备选克隆的扩增片段如图4中1～19号泳道所示。根据备选克隆的PCR扩增产物的条带大小，将克隆1的250 bp左右条带、克隆3的250 bp 左右条带、克隆8的1 000 bp左右条带、克隆10的250 bp左右条带、克隆13的250 bp左右条带、克隆14的250 bp左右条带、克隆15的1 000 bp左右条带、克隆16的250 bp左右条带进行切胶回收并做PCR产物测序，与对照细胞的犬IFN-β1基因的编码序列进行比对分析。DNA测序及比对结果如图5所示，可見备选克隆中的IFN-β1基因编码序列在2个靶向切割位点处出现了大片段的缺失或者大片段的随机插入，说明对MDCK细胞进行IFN-β1基因序列的编辑改造是有效的。

2.5 IFN-β1编码序列敲除阳性细胞克隆的生长能力比较

对备选阳性细胞克隆进行了生长能力比较，结果（表1）显示，经过CRISPR/Cas9系统操作之后的细胞克隆，生长能力有所差异，表现为生长速率减慢，最大细胞密度降低等。细胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16的细胞生长速率相对较快，以这5株细胞克隆进行禽流感病毒的增殖比较试验。

2.6 IFN-β1编码序列敲除阳性细胞克隆的病毒增殖能力比较

对细胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16以及MDCK原始细胞的病毒增殖能力进行比较，结果（表2）表明，细胞克隆1表现出最好的病毒增殖效果，H9亚型禽流感病毒JS02株在该细胞克隆中获得连续增殖的能力，HA效价逐步升高并维持在最高的水平。

3 结论与讨论

先天免疫反应是抵御病毒感染的第一道防线。宿主细胞内的模式识别受体（PRR）感知病原体相关的分子模式，在触发一系列信号级联反应后，宿主的防御机制被激活[19]。在病毒感染后，引起干扰素（IFN）的产生和分泌，这对先天免疫是至关重要的并且对适应性免疫也具有深远影响。干扰素信号传导会诱导IFN刺激基因（ISG）的转录，其进一步加强机体对病毒感染的免疫应答[20]。Ⅰ型干扰素的主要有抗病毒、抗寄生虫、抗菌、抗肿瘤等功能，其中抗病毒是IFN-Ⅰ最重要的功能之一。IFN-β的表达增加并且延长了ISG的表达，IFN-β再作用于邻近细胞，并通过正反馈机制增强Ⅰ型IFN的诱导表达[21]。对基于体外培养细胞作为增毒基质的系统而言，获得IFN-β基因敲除的细胞克隆，进而对培养群体产生均质化，提高禽流感病毒的增殖能力和连续传代效果，为解决当前禽流感细胞疫苗的生产瓶颈问题提供了一条新思路。

CRISPR/Cas系統是一种适应性免疫系统，可保护细菌和古细菌免受噬菌体和质粒的入侵[15]，是由sgRNA引导的CRISPR/Cas核酸酶系统，CRISPR/Cas9针对含有三核苷酸原间隔序列（PAM）并与sgRNA互补的基因组序列进行基因切割，从而实现基因编辑。在Cas9对靶位点进行切割后，产生的双链断裂（DSBs）可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组定向修复（HDR）进行修复[22]。与ZFN7[23]和TALENs[23-24]技术相比，CRISPR/Cas9敲除位点的设计更容易、特异性高、高效且非常适合高通量和多重化的系统;与RNAi相比，CRISPR/Cas敲除等位基因通常会导致更明显的表型、更高的信噪比和更低的假阳性[25]。CRISPR/Cas9系统的简便性、方便性和有效性使其被运用在包括基因组编辑、基因功能调查以及在动物细胞和人体细胞的基因治疗等多个方面[26]。在原核生物CRISPR-Cas适应性免疫系统中通过设计gRNA序列几乎可以编辑任何类型细胞中的任一基因，从而实现敲除突变。

本试验利用CRISPR/Cas9系统成功构建敲除了IFN-β1编码序列的MDCK单细胞克隆。该克隆生长旺盛、病毒增殖能力维持较高水平，为禽流感病毒抗原的规模增殖及相关机理研究奠定了试验基础。根据CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的优势，我们接下来将利用成功构建的CRISPR/Cas9系统进行更多细胞基因上的改造。通过将CRISPR/Cas9技术与单细胞分析技术的进步相结合，在研究病毒感染细胞后的先天性免疫反应，分析细胞免疫应答时病毒与细胞关键免疫基因之间的相互依赖性，期望能对病毒与其宿主之间的关系提供新的见解。

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