铁观音茶水提物对小鼠高尿酸血症的缓解作用

席圆圆, 徐宏彦, 刘霞, 尹慧青, 刘晓盼, 王庆路, 王清路

齐鲁医药学院, 山东省高校生物医学工程技术重点实验室, 山东 淄博 255300

近年来，随着不良饮食习惯(如高嘌呤、高盐、高糖饮食等)的增加导致高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)和痛风的发病率逐渐上升[1-2]。高尿酸血症是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日2次空腹血尿酸水平男性高于420 μmol·L-1、女性高于360 μmol·L-1，即称为高尿酸血症[3]。高尿酸血症在人群中高发，隐藏性强，危害性大。研究表明，高尿酸血症不仅是痛风的并发症，还会引起糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等其他一系列疾病[4-5]。还有不少高尿酸血症患者，可以持续不发生症状，被称为无症状高尿酸血症，但无症状高尿酸血症仍会造成患者肾脏损害，且这类患者依旧有发生痛风等疾病的风险[6-8]。

肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性异常或者是尿酸(uric acid，UA)排泄量减少都会导致尿酸蓄积量增加，二者是导致HUA的主要原因[9]。因此，调整机体相关酶活性以及相关尿酸阴离子转运体的表达是防治和缓解高尿酸血症的重要切入点。黄嘌呤氧化酶是尿酸生成过程中的关键酶，可通过抑制其活性来降低血清尿酸水平,进而达到缓解高尿酸血症的效果[10]。尿酸重吸收转运体尿酸转运蛋白1(uric acid transporter 1，URAT1)、有机阴离子转运蛋白3(organic anion transporter 3，OAT3) 、葡萄糖转运子9(glucose transporter 9，GLUT9)和有机阴离子转运蛋白1(organic anion transporter 1，OAT1)是控制尿酸代谢的重要阴离子转运体。URAT1主要表达于肾小管上皮细胞刷状缘，促进上皮细胞对尿酸的重吸收；OAT1和OAT3主要表达于肾近曲小管基底膜，其中，OAT1主要作用是将尿酸盐从管周间隙摄取入肾小管细胞，而OAT3主要作用是将尿酸盐阴离子从基底膜转运到肾近曲小管上皮细胞进而促进尿酸的排泄；GLUT9是一种高效能尿酸盐转运体，主要表达于近端肾小管[11-12]。因此，URAT1、OAT1、OAT3、GLUT9基因表达水平的变化可以反映高尿酸血症的发展程度，且URAT1、OAT3表达的增加以及OAT1、GLUT9表达的减少，对于降低血清尿酸浓度具有重要意义[13-14]。

茶水是深受我国居民喜爱的传统饮品。茶叶在国人眼中是保健佳品，而铁观音茶在日常饮用选择中尤为普遍。铁观音在六大类茶中属半发酵茶，含有茶黄素、植物碱等具有特性和功能的成分，具有治疗心脑血管疾病、降脂、预防神经退行性疾病等多种生物活性作用[15-16]。诸多研究表明，发酵茶(如红茶等)的提取物具有抑制肝脏XOD活性、减少尿酸生成以及促进尿酸排泄的作用[17-18]。有研究表明，发酵茶具有降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸的作用[17,19]，但目前有关半发酵茶对于高尿酸血症的影响的研究报道较少。因此，本研究以半发酵茶铁观音茶为原料，以高尿酸血症小鼠为研究对象，将21只已造模成功的小鼠随机分为模型组、铁观音茶水提物组、阳性药物组，7只非模型鼠作为对照组。不同处理2周后，通过观察病理切片、测定生化指标并从分子层面测定相关基因和蛋白质的表达，继而探究半发酵茶铁观音茶水提物是否具有缓解高尿酸血症的作用，以期为居民选择养生饮品提供指向作用，也为今后相关药物研发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

1.1.1 实验动物 SPF级雄性昆明小鼠40只，体重(25±2) g，购自济南金丰实验有限公司。正常饲养温度21～25 ℃，相对湿度55%～65%，12 h光照/12 h黑暗，正常饲养，自由进水、进食。

1.1.2 实验材料 铁观音茶由福建省安溪市独尊一品旗帜店生产加工。铁观音属于青茶类，介于绿茶和红茶之间，属于半发酵茶，经过采摘、凉青、做青、炒青、簸拣等工艺加工而成。

1.1.3 实验试剂 氧嗪酸钾购自上海爱纯生物科技有限公司；别嘌呤醇片购自凯玛试剂有限责任公司；次黄嘌呤购自合肥博美生物科技有限责任公司；尿酸试剂盒、XOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Trizol试剂、异丙醇、氯仿、无水乙醇等分析纯试剂购自碧云天生物技术公司；PMSF、蛋白裂解液、Qubit 蛋白定量试剂盒、TransScript Green one step qRT-PCR supermix购自全式金生物公司；高灵敏度化学发光检测试剂盒、一抗Rabbit anti-XOD和二抗HRP-anti-Rabbit IgG购自英国Abcam公司；显影液、定影液购自天津市世纪奥博商贸有限公司；化学发光HPR底物购自北京科恩堡生物科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 仪器与设备 冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)；旋转蒸发仪、分光光度计、台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；脱水机、切片机(济南丰奥有限公司)；烤片机、漂片仪(常州市郝思琳医用仪器有限公司)；新型金属浴、实时定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)；Qubit 3.0系统(美国Thermo Scientific公司)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 茶粉制备方法 称取铁观音茶叶56 g，按茶水比1∶10在沸水浴中提取30 min，过滤，再将滤渣加入280 mL沸水水浴加热15 min，合并滤液于55 ℃下旋转蒸发仪浓缩至200 mL，-20 ℃预冻2 h，再使用冷冻干燥机干燥成茶粉备用。

1.2.2 高尿酸血症小鼠模型的建立 40只SPF级KM小鼠适应性饲养7 d后，称重，随机分为正常组、模型组，正常组10只，模型组30只。模型组利用氧嗪酸钾300 mg·kg-1和次黄嘌呤250 mg·kg-1联合造模7 d[20]，摘眼球取血，每组采血时间不超过5 min，将血液于室温静置，离心取血清以检测血清尿酸(serum uric acid，SUA)浓度，当模型组测得的SUA浓度显著高于33.2 mg·L-1时，说明造模成功，由此来建立HUA小鼠模型。本实验中最终造模成功小鼠为21只。

1.2.3 动物实验设计及取样 将已造模成功的高尿酸血症小鼠21只，随机分为模型组、阳性药物组、铁观音茶水提物组，每组各7只，将它们和未经任何处理、相同环境下饲养的小鼠(空白对照组)一起饲养，并进行称重。接下来2周，空白对照组和模型组用生理盐水按照每天每只小鼠0.2 mL的量进行灌胃；阳性药物组用别嘌呤醇(5 mg·kg-1·d-1)进行灌胃；参照袁冬寅等[21]和朱创等[22]的实验中低剂量组灌胃组的茶粉灌胃量，给予铁观音茶水提物组小鼠茶粉水溶液(500 mg·kg-1·d-1)进行灌胃。

不同处理2周，在末次处理2 h后，眼后静脉丛取血0.8 mL以检测末次处理后的血液中的生化指标，随后颈椎脱位处死小鼠。取肝脏左叶，固定液固定，石蜡包埋，HE染色，用于病理组织学观察；取肝脏右前叶用于黄嘌呤氧化酶组织测定，其余部分于-80 ℃冰箱保存，用于进一步的分子水平检测。取肾脏，左肾固定液固定，石蜡包埋，HE染色，用于病理组织学观察；右肾于-80 ℃冰箱保存，用于肾脏与尿酸转运相关基因表达的检测。取小肠2 cm左右，用生理盐水反复冲洗内容物，固定液固定，石蜡包埋，HE染色，用于病理组织学观察；其余小肠于-80 ℃冰箱保存，用于肠道与尿酸转运相关基因表达的检测。

1.3 检测方法

1.3.1 高尿酸血症小鼠肝脏、肾脏、小肠病理切片的观察 研究表明，尿酸的生成主要在肝脏，尿酸的吸收和转运主要在肾脏，少部分在肠道[23-24]。因此，本研究取肝脏、肾脏、小肠固定于固定液，经冲洗、脱水机脱水、石蜡包埋、HE染色等步骤，于光学显微镜下观察病理组织切片，以直观观测相关脏器损伤情况。

1.3.2 血清尿酸含量的测定 血清尿酸检测可以在早期提示肾脏是否存在损伤。将血样于室温静置30 min后，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，然后按尿酸试剂盒说明书测定血清尿酸水平。

1.3.3 肝脏组织中XOD活性测定 肝脏组织中XOD是尿酸生成过程中的关键酶，通过检测其活性，可以在一定程度上了解体内尿酸的生成情况。取肝脏组织，称重后，每1 g组织加入9 mL预冷生理盐水，在研磨器中匀浆，制成10%肝组织匀浆，3 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，然后按黄嘌呤氧化酶(A002-1-1)试剂盒说明书测定XOD的活性。

1.3.4 高尿酸血症小鼠肾脏与肠道相关转运体mRNA及肝脏XOD mRNA表达水平的测定 通过对高尿酸血症小鼠肾脏与肠道相关转运体mRNA表达含量的测定，以观测铁观音茶水提物对HUA小鼠分子水平的影响。使用Trizol法提取肾脏中总RNA，用Qubit 3.0系统进行RNA定量，反应体系和反应程序参照实时荧光定量PCR试剂盒进行。检测肝脏XOD和肠道相关转运体mRNA表达情况与肾脏mRNA测定方法相同。引物序列借助NCBI网站(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)设计得到，其中GAPDH为内参基因，所用引物序列具体信息见表1。

表1 小鼠肾脏与肠道相关转运体mRNA及肝脏XOD mRNA引物序列Table 1 The primer sequences of kidney and intestinal related transporter mRNA and liver XOD mRNA in mice

1.3.5 Western blot检测高尿酸血症小鼠肝脏XOD基因蛋白表达 Western blot可以从蛋白质表达情况推测铁观音茶水提物对HUA小鼠尿酸的调控机制。将肝脏组织剪碎并按每100 mg组织加入1 mL RIPA裂解液与10 μL PMSF，研磨匀浆，冰上裂解30 min，14 000 r·min-1、4 ℃离心15 min，取上清液，用Qubit蛋白试剂盒和仪器Qubit 3.0进行蛋白定量，按照上样量计算，加入5×上样缓冲液，混匀，金属浴加热煮沸5 min。将定量后的蛋白样品上样10 μL，10% SDS-PAGE分离胶电泳分离，并在电泳结束后转膜，将胶上蛋白转至NC膜，在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，37 ℃封闭1 h，然后孵育相关一抗4 ℃过夜，对应二抗37 ℃孵育1 h，曝光之后，进行显影和定影，利用Image J分析目的蛋白条带与内参条带的灰度值比值，比较各组差异。

1.4 数据处理

利用Origin 8.0软件绘制图表，利用Duncan新复极差法分析数据。

2 结果与分析

2.1 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠各组织病理学影响

2.1.1 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠肝脏组织病理学影响 通过观察小鼠肝脏病理切片，从细胞层面比较各组肝脏损伤情况，进而判断铁观音茶水提物对肝脏受损的高尿酸血症小鼠的影响。如图1所示，正常组肝细胞形态结构正常，无病理现象；模型组肝细胞脂肪变性明显，可见肝细胞内大小不等，多个空泡，肝细胞体积增大，肝索增宽，肝血窦变窄；阳性药物组与模型组比较时，肝细胞病理变化明显，肝细胞内可见明显脂肪空泡，肝细胞体积增大，肝索增宽，肝血窦变窄，说明别嘌呤醇治疗高尿酸血症时，对肝脏造成了一定的损伤；铁观音茶水提物组的肝脏有一定的可逆性恢复，肝细胞形态结构正常，无肝细胞坏死现象。说明铁观音水提物对高尿酸血症小鼠的肝脏有一定的保护作用，对高尿酸血症有一定的缓解作用。

2.1.2 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠肾脏组织病理学影响 通过观察小鼠肾脏病理切片，从细胞层面比较各组肾脏损伤情况，进而判断铁观音茶水提物对肾脏受损的高尿酸血症小鼠的影响。如图2所示，正常组肾小球及肾小管结构正常，无病理变化；模型组肾小管细胞发生轻度脂肪变性，肾小管上皮细胞内可见脂肪空泡，说明造模药物对肾小管上皮细胞有轻度损伤作用；阳性药物组与模型组比较，肾小管上皮细胞脂肪变性明显，可见大小不等圆形空泡，细胞体积增大，向管腔面凸起，细胞核被挤到细胞一侧，呈扁椭圆形，肾小管管腔狭窄，说明别嘌呤醇治疗高尿酸血症时，对肾脏造成了一定的损伤；铁观音茶水提物组肾小管上皮细胞正常或可见少量脂肪变性，与模型组比较，病变轻微，大部分肾小管结构恢复正常，个别肾小管上皮细胞内可见脂肪空泡。说明铁观音水提物对高尿酸血症小鼠的肾脏有一定的保护作用，对高尿酸血症有一定的缓解作用。

图1 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠肝脏的影响(×100)Fig.1 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract >on liver in hyperuricemia mice(×100)

图2 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠肾脏的影响(×100)Fig.2 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract on >kidney in hyperuricemia mice(×100)

2.1.3 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠小肠组织病理学影响 鲜有研究报告从病理层面对高尿酸血症小鼠的肠道损伤情况进行观测，本实验通过小肠病理切片阐释了小肠损害情况。如图3所示，各实验组小鼠小肠均管壁形态结构完整，无病理变化，管腔规则，小肠绒毛结构完整，上皮细胞形态结构正常，无病理变化。说明尿酸的转运对肠道的损伤较小，几乎无法观测到影响。

2.2 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸浓度及肝脏XOD活性的影响

实验过程中实验小鼠正常生长，毛发细腻光泽，体重正常增加，整体无异常。氧嗪酸钾和次黄嘌呤联合造模后，使用血清尿酸和XOD试剂盒对小鼠相关指标进行检测，以确定造模是否成功，以及通过比较各组指标，直观显示铁观音茶对小鼠高尿酸血症的缓解作用。如表2所示，小鼠模型组和空白对照组相比血尿酸浓度显著升高(P<0.05)，XOD活性显著增加(P<0.05)，说明小鼠高尿酸血症模型造模成功；相比于模型组，铁观音茶水提物组和阳性药物组的小鼠血尿酸浓度显著降低(P<0.05)，且XOD的活性也显著降低(P<0.05)。本结果说明铁观音茶水提物可降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，并抑制肝脏XOD活性，进一步展示了其缓解HUA的潜力。

2.3 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠的mRNA的影响

通过对具有目的功能性的相关基因的观测，进一步探究铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠mRNA的影响。从图4的qRT-PCR结果可以看出，同模型组相比，铁观音茶水提物可显著恢复降低的URAT1和OAT3的表达水平(P<0.05)，以及显著减少了OAT1和GLUT9的mRNA的表达水平(P<0.05)。此外，同阳性药物组相比，铁观音茶水提物组的URAT1和OAT3的表达水平呈显著上升状态(P<0.05)。从基因层面进一步发现铁观音茶水提物对尿酸转运相关的基因存在抑制或刺激作用，即可通过抑制尿酸转运相关基因OAT1、GLUT9的mRNA表达和刺激URAT1、OAT3的表达，降低血清尿酸浓度。

注：左侧是对肠道宏观观察，右侧为微观观察。图3 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠肠道影响(×100)Fig.3 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract on >small intestines in hyperuricemia mice(×100)

表2 铁观音茶水提物对HUA模型小鼠血清尿酸浓度及肝脏XOD活性的影响Table 2 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract on >serum uric acid, xanthine oxidase and adenosine >deaminase activities in hyperuricemia mice

注：同列数据后不同小写字母表示同列数据间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。

注：不同小写字母表示同一基因内不同组别数据间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图4 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠mRNA的影响Fig.4 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract on >mRNA in hyperuricemia mice

2.4 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠XOD的mRNA和蛋白表达水平影响

利用qRT-PCR和Western blot对尿酸生成的主要催化酶XOD的mRNA和蛋白的表达水平进行检测，由此推测铁观音茶水提物对小鼠高尿酸血症的缓解机制。如图5所示，铁观音茶水提物组和阳性药物组mRNA的表达水平与模型组相比显著上升(P<0.05)，且与Western blot结果一致。推测可能是茶水提物中某种成分抑制XOD的活性，使得不具有催化活性的XOD蛋白增加，对XOD基因的转录表达造成一种正反馈，即增加XOD基因的转录、翻译，继而又产生大量无催化活性的XOD蛋白，从而产生XOD的mRNA和蛋白水平均上调、但尿酸生成量却下降的现象。

注：不同小写字母表示数据间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图5 铁观音茶水提物对高尿酸血症模型小鼠XOD的影响Fig.5 Effect of Tieguanyin tea aqueous extract on XOD in hyperuricemia mice

3 讨论

正常人体尿液中产物主要为尿素，含少量尿酸。尿酸是嘌呤代谢的最终产物，当进行高嘌呤饮食或者肝肾疾病导致尿酸生成和排泄的平衡被打破时，均可导致血清中尿酸升高[5]。如果机体长期处于尿酸过高的状态，会导致高尿酸血症，进而发展成痛风、高血压等一系列代谢性疾病[4]。因此很多代谢性疾病发生、发展的必经之路就是高尿酸血症，如果能够在这个阶段进行有效调控，就可以大大降低罹患痛风、高血压等疾病的患病风险，使居民生活质量得到进一步的改善。

本研究主要采用氧嗪酸钾和次黄嘌呤联合造模，升高血清中尿酸的浓度，使小鼠体内尿酸生成和排泄处于失衡状态，从而形成高尿酸血症动物模型。模型小鼠经过2周处理后，小鼠各个组织的病理切片显示，别嘌呤醇使小鼠的肝脏出现明显的脂肪空泡，肝细胞体积增大，肝板增宽，肝血窦变窄，受损严重；别嘌呤醇还使小鼠肾小管上皮细胞脂肪变性明显，出现大小不等的圆形空泡；而铁观音水提物组未有明显改变，说明铁观音茶水提物对肝脏和肾脏的损伤要小于别嘌呤醇。尿酸的吸收和转运主要在肾脏，少部分在肠道[24]，但通过病理切片未见肠道有明显损伤，说明高尿酸血症可能对肠道影响不大，其严重影响的脏器主要为肝脏和肾脏。由病理切片可知，常规药物治疗也会造成肝、肾的二次损伤，所以研发有调节血尿酸作用、但损害小或无损害药物成为了新的出发点，而本研究中的铁观音茶水提物为此类药物的研发提供了新思路。

在本研究中，末次处理2 h后进行眼球取血，用以检测血清尿酸浓度，通过观察发现，阳性药物组和铁观音茶水提物组相比于模型组，血清中尿酸水平均降低，且均低于对照组，但铁观音茶水提物组降尿酸水平更为明显，提示铁观音茶水提物可能具有缓解高尿酸血症的作用。

在体内，尿酸的生成途径为：腺嘌呤核苷→次黄嘌呤核苷→次黄嘌呤→黄嘌呤→尿酸，整个过程通过黄嘌呤氧化酶催化[22]，实验表明阳性药物组和铁观音茶水提物组XOD的活性相比模型组均显著降低(P<0.05)。可见铁观音茶水提物对高尿酸血症小鼠的黄嘌呤氧化酶的活性具有一定的抑制作用，继而影响整个尿酸生成途径，从而使尿酸的生成减少。铁观音属于半发酵茶，发酵程度在20%～70%，所以铁观音可能具有发酵茶叶和未发酵茶叶的双重特性。高文波和翁国斌[25]研究发现绿茶的茶多酚能抑制细胞中XOD的活性，防止病理条件下自由基的爆发，铁观音茶水提物缓解高尿酸血症也可能与这一机制有关。

蛋白质水平上的结果也可部分验证铁观音水提物能够缓解高尿酸血症。现今市场上常见的治疗高尿酸血症的药物为别嘌呤醇等，其治疗原理为别嘌呤醇和次黄嘌呤结构相似，化学结构上只是N7与C8互换了位置，因此可以特异性结合黄嘌呤氧化酶，减少黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤结合，最终抑制尿酸的生成[26]。而本研究中，铁观音水提物组XOD相关蛋白的表达相对于模型组增加，但尿酸生成却减少，说明铁观音水提物中某成分可能和别嘌呤醇等药物一样阻断了黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤生成黄嘌呤进而生成尿酸的过程，缓解了高尿酸血症，反而又正反馈激活了XOD基因表达上调，但相关成分待查证。

铁观音茶水提物对肾脏和小肠中阴离子转运体的影响也是本研究探究的方向之一。我们查阅了与尿酸转运阴离子转运体相关度较高的文献[13]，之后观察相关基因表达是否受到铁观音水提物的影响。URAT1主要表达于肾小管上皮细胞刷状缘，OAT1和OAT3大量表达于肾近段小管基底膜，而GLUT9在小肠表达[27]，本研究发现铁观音水提物能升高URAT1和OAT3的mRNA表达水平，可降低GLUT9和OAT1的mRNA表达水平。说明铁观音茶水提物缓解高尿酸血症的可能与调整体内阴离子转运体的表达有关。先前周启蒙等[28]在高尿酸血症模型小鼠上证实，茶黄素能通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、调节相关阴离子转运体mRNA与蛋白表达而实现降低血清尿酸含量，且铁观音茶中茶黄素含量显著高于其他类型茶叶，仅次于发酵茶[29]；本研究中发现的铁观音茶水提物能调控相关阴离子转运体mRNA与蛋白的表达水平，从而明显降低小鼠血清尿酸含量，可能也与铁观音水提物中含有茶黄素这一成分有关。但相关机制和有效成分仍需进一步探究。

茶叶因为其常见且功效诸多的特点[30-31]，经常走进科研工作者的视野，尤其在其对高尿酸血症的缓解作用方面。但现今大部分研究都围绕探求发酵茶(如红茶和黑茶等)的作用及机制[22,32]，而此类茶叶在国人的认购度往往不及铁观音等半发酵茶，故本研究对半发酵茶中的铁观音是否能够缓解高尿酸血症进行进一步研究，为居民购买茶叶提供一定的指导。现今，市场上治疗高尿酸血症药物有限，且大多对肝、肾有强损害性，且患者依从性差。不如从根源抓起，为具有罹患高尿酸血症风险的居民提供一条简便可行的养生方式，且铁观音茶水提物作为一种茶叶发酵后的产物，其安全性大大提高，为已经患病的居民提供一种辅助性的安全有效的降尿酸的方式。本研究结果也为今后相关药物的研发提供了参考。但本研究也具有局限性，虽然解析了铁观音茶水提物对血清尿酸的降低作用，但没能确定水提物中哪种成分有此功效。此外，动物模型中的基因和蛋白质的敏感性和多样性和人体相比也是有一定差异的，后续还要进行更多的临床实验，进一步验证和探究相关机制。