发酵法生产制备番茄红素的工艺研究

王英燕, 陈文娜, 贾存江, 房树标, 秦斌, 朱正乔

江苏神华药业有限公司, 江苏 淮安 211600

番茄红素是一种类胡萝卜素，最早由Hartsen于1873年从莓果中分离发现，为结晶性深红色色素[1]。番茄红素在自然界中的西瓜、南瓜、李子、柿子、胡萝卜等果蔬中都有存在，但天然含量较低，其在成熟的红色果实中含量较高，其中含量最高的是番茄，仅30～140 mg·kg-1[2-5]。番茄红素具有很好的抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功能，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域[6-8]。

目前，番茄红素的生产方法主要包括天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法番茄红素产量低，成本高且受制于原料来源；化学合成法存在安全隐患；而微生物发酵法具有工艺简单、生产效率高、生物活性与天然植物提取物一致等优点[9-11]，越来越受到关注。

已知的可用于发酵法生产番茄红素的微生物有经基因改造的酵母菌[12]、红色细菌[13]、革兰氏阴性非光合菌[14]及三孢布拉氏霉菌。三孢布拉霉是国内外唯一能够实现工业化生产胡萝卜素的菌株，而番茄红素是胡萝卜素发酵生产过程中的中间产物，因此，三孢布拉霉是番茄红素发酵生产的理想菌株[15]。本研究利用液态深层发酵技术，采用三孢布拉氏霉菌进行发酵生产，优化发酵中间过程参数，旨在进一步提高番茄红素的发酵产量，为大规模工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种 三孢布拉氏霉菌正菌(+)和负菌(-)，由本公司菌种保藏中心筛选保存。

1.1.2 培养基 种子培养基：淀粉6%、葡萄糖1%、黄豆饼粉3%、亚油酸0.001%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.025%、维生素B1 0.001%。

发酵培养基：淀粉4.5%、葡萄糖1.8%、玉米浆2.5%、黄豆饼粉2.8%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.02%、维生素B1 0.002%。

1.1.3 试剂 番茄红素标准品购自美国Sigma公司；淀粉、葡萄糖购自南京京润生物科技有限公司；花生油、菜籽油、玉米油购自山东鲁花集团有限公司；黄豆饼粉、大豆油购自阜丰集团有限公司；维生素B1购自苏州卓鑫生物科技有限公司；吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑、亚油酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、石油醚、二氯甲烷(均为分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9162电热恒温培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)；MS304S分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；GZX-GFC101-1-S电热恒温鼓风干燥箱(上海博泰实验设备有限公司)；GWA-UN1F-F10超纯水机(上海普析分析仪器有限公司)；HYG恒温摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)；AWD-ZN-10L全自动灭菌发酵罐(浙江百力仕龙野轻工装备有限公司)；CL5R大容量冷冻离心机(上海圣科仪器设备有限公司)；UV1780紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；HTZ-6020L数显真空干燥箱(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.3 番茄红素的发酵制备工艺

三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株分别活化后在28 ℃、180 r·min-1条件下振荡培养48 h。随后先将负菌株按一定比例接入发酵罐培养，24 h后再将正菌株按一定比例接入发酵罐培养。发酵42 h时，添加代谢流阻断剂，检测菌体生长量、番茄红素含量。当番茄红素含量不再增加，发酵终止。发酵前期搅拌速度设定为200 r·min-1，42 h后搅拌速度设定为280 r·min-1。整个发酵过程通风比1∶0.6；温度28 ℃。

1.4 番茄红素的定量检测

准确称取番茄红素标准品2 g，利用20 mL二氯甲烷溶解后用石油醚定容至100 mL，迅速将上述标准溶液稀释成不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1)于502 nm处测定吸光度，绘制番茄红素含量标准曲线[16]。

将发酵液离心(4 000 r·min-1,5 min)用超纯水洗涤3次，105 ℃恒定质量后称重，计算菌体生物量[17]。洗涤后的菌体在40 ℃真空干燥后研磨破壁，用石油醚萃取至溶液无色，合并萃取液转入棕色容量瓶中，用石油醚定容。以石油醚为参照在502 nm处测定吸光度值，用标准曲线计算出番茄红素含量[18]。

1.5 单因素实验

1.5.1 正负菌株接种比例对番茄红素合成的影响 三孢布拉氏霉菌分为正菌和负菌，只有2种菌混合培养时才能获得高产量的番茄红素，负菌是主要的生产菌，正菌作为配对菌株提供三孢酸等激素刺激负菌中番茄红素合成[19]。正负菌接种比例对发酵液中菌丝体形态有较大影响，增加负菌在混合培养过程中的优势，可以提高番茄红素的产量[20]。选择1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1负正菌株接种比例进行接种培养，考察接种比例不同对番茄红素合成的影响。

1.5.2 代谢流抑制剂对番茄红素合成的影响

在三孢布拉氏霉菌的代谢过程中，最终产物是β-胡萝卜素而不是番茄红素，而β-胡萝卜素是由番茄红素经过番茄红素环化酶的催化生成，为获得大量番茄红素，必须抑制番茄红素环化酶活性。通过添加抑制剂的方法阻断番茄红素向β-胡萝卜素的环化反应，进而提高番茄红素的生物合成转化率，含氮类杂环化合物(如吡啶、咪唑及其衍生物)均具有阻断作用[21-23]。分别选用0.05 g·L-1的吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑4种阻断剂，考察其对番茄红素发酵的影响。

1.5.3 外源性植物油对番茄红素合成的影响

在番茄红素发酵生产过程中，外源性植物油被菌体分泌的胞外脂肪酶分解吸收，菌体内脂肪酸饱和度增加，其分解产物乙酰辅酶A不仅可进入三羧酸循环，为细胞生长提供能量，还可作为脂肪和番茄红素合成的共同前体物质[24]。分别选用3 g·L-1的大豆油、菜籽油、花生油、玉米油作为外源性植物油，考察其对菌体生物量和番茄红素产量的影响。

1.6 响应面法优化番茄红素的发酵制备工艺

在采用响应面分析法时，实验中得到的响应面拟合方程在靠近番茄红素最高产区才能较好地反映真实情况，所以应该先逼近最高番茄红素产区后再建立有效的拟合方程。根据单因素法筛选出的显著因子效应设定它们的变化步长，进行最陡爬坡实验，寻找最高番茄红素产区。根据Box-Behnken原理进行设计，实验因素和水平见表1。

表1 响应面分析实验水平表Table 1 Response surface analysis experiment level table

1.7 统计分析

每个实验点数据独立进行3次以上，利用Design-Expert、origin 8.5、Microsoft 2013对数据进行处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 番茄红素标准曲线

准确称取番茄红素标准品2 g，用20 mL二氯甲烷溶解后再用石油醚定容至100 mL制成番茄红素标准液，将上述标准溶液稀释成不同浓度的标样于502 nm处测定吸光度。如图1所示，根据番茄红素含量和吸光值的线性关系，建立番茄红素标准曲线，拟合出回归方程：y=0.277 9x+0.038 2，R2=0.997 9。根据回归方程R2可知，在0～3.0 g·L-1范围内，番茄红素含量与吸光值具有良好的线性关系。

图1 番茄红素含量标准曲线Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 单因素实验

2.2.1 正负菌株接种比例对番茄红素合成的影响 为了考察三孢布拉氏霉菌正负菌株接种比例对番茄红素合成的影响，发酵时，负菌∶正菌分别按比例1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1接种，发酵结束后，菌体生物量与番茄红素产量如图2所示。可以看出，接种比例过小，出现负菌生长慢的劣势；接种比例过大，导致正菌的生长受阻，不能为负菌提供足够的三孢酸等刺激物，从而导致番茄红素产量下降。结果表明，负菌∶正菌接种比例8∶1时，番茄红素产量最高，达到1.22 g·L-1，因此，负菌∶正菌接种最佳比例为8∶1。

2.2.2 代谢流抑制剂对番茄红素合成的影响

为了考察代谢流抑制剂对番茄红素合成的影响，分别向培养基中添加0.05 g·L-1吡啶、咪唑、2，6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑，CK为对照组(无添加)，发酵结束后，菌体生物量及番茄红素产量如图3所示。可以看出，不同抑制剂对番茄红素合成转化率影响不同，吡啶和咪唑的抑制效果比它们的衍生物差，效果最好的是2,6-二甲基吡啶，番茄红素含量提高了62.5%。因此，选择2,6-二甲基吡啶为最佳代谢流抑制剂。

2.2.3 外源性植物油对番茄红素合成的影响

为了考察外源性植物油对番茄红素合成的影响，分别向培养基中添加3 g·L-1大豆油、菜籽油、花生油、玉米油，CK为对照组(无添加)，发酵结

图2 正负菌株接种比例对番茄红素合成的影响Fig.2 Effect of the ratio of positive and negative strains on the concentration of lycopene

图3 环化酶抑制剂对番茄红素合成的影响Fig.3 Effect of different cyclase inhibitors on the concentration of lycopene

束后，菌体生物量及番茄红素产量如图4所示。可以看出，添加大豆油后单位菌体番茄红素产量较其他实验组高，生物量提高了35.7%，番茄红素含量提高了39.6%，这可能是因为大豆油富含亚油酸有利于生物量的提升，促进了番茄红素的合成。综合考虑，选择大豆油作为外源性植物油辅助发酵。

图4 外源性植物油对番茄红素合成的影响Fig.4 Effect of different plant oils on the >concentration of lycopene

2.3 响应面法优化番茄红素的发酵制备工艺

2.3.1 响应面实验设计结果及方差分析 选取负正菌株体积比例(A)、2，6-二甲基吡啶浓度(B)、大豆油浓度(C)3个因素进行响应面设计，以番茄红素的产量为响应值；根据Box-Behnken原理设计了3因素3水平共20个试验点的响应面中心组合实验。实验设计及结果见表2。

运用Design-Expert软件分析表2实验数据，拟合出的方程模型为：

Y=1.41-0.027A+0.15B+0.071C-0.032AB+0.065AC-0.035BC-0.043A2-0.061B2-0.034C2

响应面模型的方差分析如表3所示。由表3可知，一次项B、C和二次项C2对番茄红素的产量有极显著影响，二次项B2与交互项AB、AC、BC对番茄红素产量有显著影响。说明进行实验的因素与番茄红素的产量不是简单的正比关系。同时响应面模型极度显著，失拟项对番茄红素的产量影响不显著，说明非实验因素对实验影响程度较低，可以用此模型进行番茄红素产量的模拟；系数R2为0.923 2，说明该回归模型与实际结果拟合较好。此外，一次项A对番茄红素的产量无显著影响，但其在单因素实验中表现出对番茄红素产量的明显影响，具体原因在后续实验计划中会继续考察。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 二阶回归模型方差分析表Table 3 Table of variance analysis of second order regression model

注：*和**分别表示差异在P<0.05和P<0.01水平上具有统计学意义。

2.3.2 响应面图和等高线图分析 考虑到番茄红素的单位产量较其他发酵产品而言，产量较低且提高较困难，因此需要密切关注能够促使其增产的一切因素。为了更直观地反映各因素间交互作用显著程度，根据回归方程做出各因素对番茄红素产量的响应面图和等高线图。其中，等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱大小，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。从图5可知，负正菌株接种比例、2,6-二甲基吡啶和大豆油的含量两两交互作用对番茄红素产量的影响均显著，其响应面图对应的等高线图均呈椭圆。

图5 影响番茄红素产量的各因素响应面图和等高线图Fig.5 Response curves and contour map of the factors influencing lycopene yield

通过模型对培养基最优配比的预测可知，当培养基中负菌∶正菌体积比为6∶1、2，6-二甲基吡啶0.09 g·L-1、大豆油浓度3.57 g·L-1时，番茄红素产量达到最大值(1.53 g·L-1)。用此工艺条件进行5次发酵，实际平均发酵产量为1.51 g·L-1，菌体生物量51 g·L-1，说明该模型可以较好地预测实际发酵情况。

3 讨论

番茄红素作为一种对人体有益的类胡萝卜素，其抗癌抑癌、抗氧化性、细胞生长代谢调控等特征在大健康及医疗领域将会产生巨大的作用。然而，传统的提取方法和化学合成法无法满足需求。微生物发酵法因具有工艺简单、生产效率高、产物的生物活性与天然植物提取物一致等优点，逐渐受到关注，但番茄红素产量会根据发酵菌株的不同而变化。王敏等[25]以1株龟裂链霉菌为出发菌株经诱变筛选及工艺优化使番茄红素的产量达到230 mg·L-1；汪福源等[26]通过诱变红酵母，获得可生物合成番茄红素的RY-17菌株，其在优化后的工艺条件下番茄红素的产量仅为5.53 mg·L-1；任龙[27]以三孢布拉霉为出发菌株，经过2次的诱变筛选，在最优的工艺条件下番茄红素的产量可达1.295 g·L-1。由此可见，三孢布拉霉是目前发酵生产番茄红素产量最优的菌株。

本研究在单因素实验的基础上利用响应面法优化代谢控制条件，最终确定当三孢布拉氏霉菌负正菌株接种比例6∶1，添加番茄红素环化酶抑制剂2,6-二甲基吡啶0.09 g·L-1，以3.57 g·L-1大豆油为外源性植物油辅助发酵时，可使发酵液中的番茄红素产量达1.51 g·L-1，菌体生物量51 g·L-1。本研究通过培养基的优化可以使番茄红素的产量稳定的维持在1.5 g·L-1，相对于任龙[27]的研究，番茄红素的产量提高了15个百分点，离番茄红素的大规模工业化生产更近一步。然而，利用发酵法生产番茄红素的产量依旧较低，这意味着今后在提高番茄红素产量的方面需要继续探索，可通过外源添加提高产量，如维生素辅酶、还原力(NADP、NADPH)、前体、中间代谢产物的不断优化可能会使番茄红素的产量继续提高。