鲜切香菇贮藏过程中质构变化与自溶自噬分析

赵爽 苏哲 谷彤彤 高琪 荣成博 宋爽 刘宇

（北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097）

香菇（Lentinula edodes），又名花菇、香蕈、香菌、冬菇，是我国特产及出口量较大的食用菌之一［1］，也是市场上重要的食用菌消费品种。香菇富含蛋白质、氨基酸、多种维生素和具有免疫调节作用的香菇多糖，可以提高人体免疫力，具有防癌抗癌、降血压血脂、抗氧化抗炎症等药理作用［2-5］。新鲜香菇组织含水量高，新陈代谢旺盛，容易出现老化、褐变等品质下降的现象，目前在保鲜加工领域中，研究多集中于整体鲜菇保鲜技术的开发，如低温贮藏、涂膜处理、辐照除菌等，叶静君报导低温气调可以减少香菇的失重率、降低多酚氧化酶的活性，减少褐变［6］；李艳杰等［7］报道利用1 μL/L 1-MCP处理香菇可以保持其感官品质，防止褐变、提高氧化能力，但对于鲜切香菇加工的研究未见报道。

食用菌鲜切是果蔬鲜切加工领域中的一个分支，相关的研究较为缺乏，食用菌子实体含水量高，呼吸蒸腾作用强，经过鲜切加工后，组织会受到机械损伤，引起一系列生理生化反应，同鲜切果蔬产品类似，发生组织软化、氧化褐变、风味下降、腐败劣变等问题［8-12］，同时真菌细胞在受到损伤后激发自溶自噬的程序，鲜切食用菌在环境和老化自溶机制的共同作用下，组织结构如何变化，细胞如何消融，这一过程仍然没有被阐明揭示。

本研究以香菇作为原材料，根据鲜切最小加工原则，对其进行处理包装和贮藏，通过质构分析结合鲜切香菇的衰老变化，研究香菇在鲜切加工后品质劣变、老化自溶时组织微观现象以及细胞内超微结构的改变，阐述鲜切香菇贮藏期的自噬过程，旨为鲜切香菇加工技术的保鲜与应用提供理论分析。

1 材料与方法

1.1 材料

香菇选用市场上常见的“0912”品种，由北京三宝香农业科技发展有限公司提供，采摘当天挑选无机械损伤、菇形大小、菌盖厚度、重量均一的香菇，清洗、沥干后切根。将香菇切成3 mm 左右薄片，装入食品密封包装袋后封口（每袋10±0.2 g），分别置于低温（4℃）、常温（25℃）条件下保存，每个处理设置3 个重复，每隔2 d 取样一次至样品完全腐烂，将每一时间点的样品进行处理，开展品质以及抗氧化能力检测。

1.2 方法

1.2.1 品质指标测定

1.2.1.1 硬度 参照Ye 等［13］的研究方法，略有改动。使用探针直径为3 mm 的硬度计（FR-5120）测定香菇片菌盖中心部位的硬度，每个处理进行6 次测定，取其平均值。

1.2.1.2 失重 采用称重法［14］，记录同一样品在整个储藏过程中质量变化。

失重率 =（贮藏前的重量-贮藏后的重量）/贮藏前的重量 ×100%

1.2.1.3 褐变 参考王清章等［15］的方法，略有改动。将1 g 样品加入9 mL 的蒸馏水，破碎匀浆，离心，取上清稀释液10 倍后，测定410 nm 处的测定吸光度（A），以此用来判断褐变程度。

1.2.2 抗氧化能力测定 准确称取5 g 组织样品，按重量（g）∶体积（mL）=1 ∶9 的比例加入9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制成10%组织匀浆液，4 000 r/min 离心10 min，取上清备用，作为待检测样品。

1.2.2.1 总抗氧化能力（AOC）测定 取低温贮藏条件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常温贮藏条件下0、2、4、6、8 d 的样品，利用总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行检测。

1.2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）测定 取低温贮藏条件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常温贮藏条件下0、2、4、6、8 d 的样品，利用超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行检测。

1.2.2.3 过氧化氢酶（CAT）测定 取低温贮藏条件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常温贮藏条件下 0、2、4、6、8 d 的样品，利用过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行检测。

1.2.3 老化自溶结构变化

1.2.3.1 菌丝结构分析 对鲜切香菇和老化样品进行取样，选取香菇片中间、非菌褶部位，用消毒刀片切取小块组织（0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm），加入到2.5%的戊二醛磷酸缓冲液（GA）中固定12 h，固定后的样品用消毒刀片切成单层组织，置于载玻片上，覆上盖玻片后轻轻捻压分散组织，光镜下观察组织形态，通过计数法统计菌丝数量和菌丝中锁状联合数量。

1.2.3.2 细胞膜结构分析 对鲜切香菇和老化样品进行取样，子实体组织用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffered saline PBS）洗涤3 次，去除GA 固定液，用10 μmol/L 细胞膜红色荧光探针（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate DiI）标记液浸没组织切片，避光浸染20 min，用0.1 mol/L PBS 冲洗切片3 次，将切片置于载玻片上，覆上盖玻片，在荧光显微镜下观察细胞膜的着色情况。

1.2.3.3 细胞核检测分析 对鲜切香菇和不同处理的样品进行取样，切片，组织用0.1 mol/L PBS 洗涤3 次，用乙醇-乙酸固定液处理组织30 min，在样品上滴加50 μL 8 mg/L 的DAPI 孵育1 h，滴加抗荧光淬灭封片液50 μL，覆上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

1.2.3.4 细胞内部DNA 碎片分析 对鲜切香菇和不同处理的样品进行取样，切片，利用2.5%的戊二醛磷酸缓冲液（GA）固定12 h，去除GA 固定液，用0.3% 的Triton X-100 溶液孵育5 min，再用PBS 洗涤2 次，在样品上滴加新鲜配置的TUNEL（TdT 酶5 μL，荧光标记液45 μL），37℃避光孵育1 h，用PBS 洗涤3次，滴加抗荧光淬灭封片液50 μL，覆上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

1.2.3.5 细胞超微结构分析 对鲜切香菇和不同处理的样品进行取样，利用2.5%的戊二醛磷酸缓冲液（GA）固定12 h，采用乙醇脱水处理后，包埋于电镜专用树脂中，将包埋样品送往清华大学公共检测平台利用透射电镜（TEM）分析细胞内的结构变化。

1.2.4 数据分析 所得数据均由平均值和标准偏差表示，每个处理重复3 次。利用Excel 2016 软件进行方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示显著性差异。

2 结果

2.1 鲜切香菇外观分析

鲜切香菇片随着贮藏期的延长，其表观形态明显发生劣变。从产品表观分析新鲜香菇经过鲜切加工后贮藏初期会出现菇体褐变、失水干缩、菇体变软的现象，说明菇体已经开始发生明显的生理改变以及加速老化进程；随着贮藏期的延长，菇体表面出现黏腻、出水，气味物质发生改变的现象，说明此时菇体已经开始在多种作用下发生老化消融的现象。通过观察发现贮藏在25℃条件下，香菇切片在第8 天严重褐变腐烂劣变，设为实验终点；贮藏在4℃条件下，第16 天设为实验终点。

2.2 不同温度条件下鲜切香菇品质的变化

硬度与香菇片腐败程度存在直接关系，是品质的属性之一。鲜切香菇片的硬度随贮藏期的延长而下降（图1），各处理组在前2 d 均表现出硬度显著下降（P＜0.01），其后4℃的贮藏条件相对于25℃的贮藏条件菇片软化进程减缓，在第6 天的时候，4℃处理组硬度显著高于25℃处理组（P＜0.05）。

图1 不同温度对鲜切香菇硬度的影响

香菇经过鲜切加工后增加了表面积，水分蒸发量增大，失水达到一定程度时，对其品质和生理代谢都会产生很大的影响。在4℃和25℃的贮藏条件下，鲜切香菇的失重率随着贮藏期的延长而增加（图2）。由于温度可以影响菇体内水分的蒸发，因此25℃的贮藏条件下的失重率显著高于4℃的贮藏条件下的失重率，在第4 天时25℃处理组的失重率为8.3%，而4℃处理组的失重率仅为3%，在25℃贮藏条件的实验终点第8 天，失重率达到了21%，4℃贮藏条件的实验终点第16 天，失重率为14.7%。因此4℃的贮藏条件更有利减少鲜切香菇的水分流失，保持良好的外观。

图2 不同温度对鲜切香菇失重率的影响

褐变是评价鲜切香菇品质的指标之一。图3 显示，25℃贮藏组在第4 天之后褐变出现激增，褐变程度显著高于4℃贮藏组（P＜0.05）。相比较而言， 4℃贮藏组褐变程度平稳变化，说明4℃的贮藏条件可以保持香菇片的颜色，减少褐变的发生。

图3 不同温度对鲜切香菇褐变的影响

2.3 不同温度对鲜切香菇品质抗氧化活性的影响

由图4 可以发现，随着贮藏期的延长，各种温度条件下，香菇切片的抗氧化能力都是呈现下降的趋势，其中在25℃的贮藏条件下，抗氧化能力的损失更为显著。AOC 活性检测结果显示在第2、4 天时，25℃处理组的总抗氧化活性已经显著低于4℃处理组（P＜0.05）。在第2、4 天时，CAT 活性在不同处理组间差异最大（P＜0.05），4℃处理组的CAT活性分别是25℃处理组的1.4 倍和2.6 倍。SOD 活性检测结果同样显示出25℃处理组的酶活性下降为迅速，在第8 天时，其活性仅为4℃处理组SOD 活性的28.5%。

从生理生化指标分析结果中可以发现，低温贮藏条件有利于鲜切香菇的品质保持，低温环境可以减少蒸腾作用，减少微生物的繁殖，减缓组织氧化的进程，从而降低了菇体的软化、褐变和腐败，是延长鲜切香菇货架期的重要储存条件。

2.4 组织微观结构变化及自噬现象

香菇在采收后仍然处于生命旺盛期，切片镜下可观测到细胞间的锁状联合结构，通过计算相同菌丝数中锁状联合的比例发现，锁状联合结构在所有细胞中占比约为25%（图5-A）。而在老化切片中，菌丝边缘壁膜结构模糊不清，推测开始发生自溶自噬现象，未见到菌丝细胞间存在锁状联合的结构，说明此时切片组织已经老化（图5-B）。

图4 不同温度对鲜切香菇抗氧化活性的影响

图5 菌丝体锁状联合结构消失（400×）

利用DiI 探针对贮藏末期的香菇片进行染色，对比光镜下的细胞结构，可以发现细胞内的膜结构出现断裂，细胞膜发生消融，已经呈现出不完整的状态（图6），推测细胞膜的缺失与香菇片的软化具有一定的关联。

图6 DiI 标记细胞膜的缺失现象（400×）

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA 断裂时，暴露的3′-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下加上绿色荧光探针荧光素进行标记，TUNEL 染色法也是基于此，从而标记了细胞内断裂的DNA 片段，通过激发后，可在515-565 nm 处检测到绿色荧光，利用荧光显微镜可以观察到细胞内DNA 断裂的情况。DAPI 是一种能够与双链DNA 结合的蓝色荧光染料，它标记的是细胞核内完整的DNA，此染料需要在紫外光下激活，在460 nm处检测蓝色荧光，用以表示细胞核的状态。

如图7 所示，对比光镜菌丝形态，经过TUNEL染色后，菌丝内出现很多绿色的荧光亮点，说明此时菌丝体中存在大量的DNA 碎片，而DAPI 染色后，未在菌丝体中发现明显的核状着色体，说明此时的细胞中不存在细胞核。结果暗示细胞内伴随着DNA的断裂，细胞核已经消融，细胞进入到自溶自噬进程。

图7 荧光标记细胞核和DNA 的断裂现象（400×）

通过透射电镜的检测，可以直观的观察到细胞宏观以及内部的结构形态变化，从图8-A 中可以观察到新鲜香菇切片细胞外层具有厚实的细胞壁，细胞内部细胞器清晰，胞质均匀。对比图8-B 显示的老化细胞，可明显发现衰老细胞内胞质消融，胞内液泡增大，胞壁变薄，细胞形态发生明显变化。

图8 透射电镜下新鲜香菇和老化香菇细胞比较

进一步从微观角度分析细胞内的结构变化，图9 显示的是细胞内的超微结构。新鲜香菇切片细胞中可观测到细胞壁厚实，胞质均匀，内部细胞器结构清晰，液泡大小正常。而老化细胞形态差异较大，可见胞壁消融、缺失的现象，细胞发生破损，同时胞内可见褐色沉淀，细胞颜色加深（图9-B），部分细胞中出现吞噬泡，发生自体自噬现象（图9-C），最终胞内只存有大量的空泡体，细胞器消失，胞壁裂解的现象（图9-D）。

图9 透射电镜下超微观结构观察

3 讨论

鲜切加工技术的发展为市场提供了新鲜、营养、方便的食品，目前鲜切对象分为鲜切蔬菜、鲜切水果及鲜切中药材3 大类，涉及的品种主要有生菜、马铃薯、西兰花、黄瓜、菠萝、苹果、三七、延胡索等［16-20］。对于鲜切食用菌的研究报道为数不多，陈学玲［21］研究了次氯酸钠、二氧化氯、过氧化氢、乙醇4 种杀菌剂对鲜切香菇品质的影响发现，150 mg/L NaClO 抑菌效果最佳；赵春霞［22-23］研究发现90%高体积分数氩气能维持香菇的可溶性固形物含量，保持硬度和白度，同时0.5%壳聚糖+1.5%海藻酸钠涂膜处理能够提高氩气的效果。目前鲜切果蔬加工技术的研究侧重于清洗除菌、物理保鲜、化学涂膜保护、气调包装等方面的研究。针对食用菌组织脆嫩、含水量高、代谢旺盛易老化的特点，相关的基础和技术研究未见报道。

本研究通过加工破坏了香菇子实体的整体结构，增加了菌肉和菌丝与外界环境的接触。外界的不利因素，如微生物的浸染、氧气的氧化等，伴随着菌体的应激自噬机制，加速了一系列的生理生化反应，使裸露组织加速劣变。品质及抗氧化能力检测发现低温贮藏环境可以保持鲜切香菇的品质，减缓褐变的速度，降低菇体抗氧化能力的损失，延长货架期，这一研究结果与寇莉萍等的研究一致［6］。研究发现在储藏前期菇体会发生明显的软化，这与组织的应激损伤机制有一定的关系，激活了体内的自噬水解酶，组织启动了进入自噬凋亡程序，利用显微技术也印证了自噬的特征现象，观察发现组织细胞内的正常生理结构发生劣变，出现胞壁断裂、胞膜消融、自噬体吞噬细胞器、大量DNA 断裂、细胞核消失以及细胞解体等现象，进一步结合细胞凋亡的相关分析可以对鲜切香菇自溶自噬的现象进行机理层面的揭示。

4 结论

本研究结果显示香菇切片在贮藏期出现的最主要问题是切片软化、褐变和抗氧化活性降低，从而降低了货架期的产品品质。微观结构研究显示鲜切香菇经过机械损伤后激发了自溶自噬机制，细胞内出现胞壁断裂、胞膜消融、自噬体吞噬细胞器、大量DNA 断裂、细胞核消失以及细胞解体等现象，是引发香菇片软化重要原因之一。本研究结果展示了鲜切香菇在不同贮藏温度下的生理生化的改变，揭示了产业化生产需要面临的技术问题，鲜切香菇工厂化生产需要在减少微生物污染、抗氧化、失水等问题上加大攻关，从而提高鲜切产品的品质，延长产品的货架期。