谷氨酸棒杆菌Cgl0864 基因强启动子的鉴定

张 献，张玮祎，李川敏，牛树启，臧卫平，徐大庆

（1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000；2. 河北省保定市竞秀公园管理处，河北 保定 071000；3.河北省保定市龙潭公园管理处，河北 保定 071000）

作为一种重要的食品级微生物，谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）已被广泛用于各种氨基酸的工业化生产［1］。早期氨基酸工业生产菌种都是通过传统诱变育种发展而来，随着谷氨酸棒杆菌基因组测序完毕及其生理学，生物化学和遗传学知识的大量积累，代谢工程育种已经成为获得谷氨酸棒杆菌高产菌株的主要手段［2-3］。另外，由于具有蛋白分泌能力但不产胞外蛋白酶［4-5］，谷氨酸棒杆菌被认为是一个理想的重组蛋白生产宿主菌，许多使用其进行重组蛋白分泌生产的研究已见报道［6］。基因过表达是微生物遗传改造的主要研究内容，而强启动子是实现基因过表达的关键DNA 元件。20世纪80 年代末起，研究人员开始了谷氨酸棒杆菌基因启动子的鉴定工作［7-8］，目前，一些糖代谢及氨基酸代谢相关基因的启动子已被相继鉴定［9］。

通过比较不同谷氨酸棒杆菌启动子序列，Pátek等认为谷氨酸棒杆菌的启动子结构与大肠杆菌启动子相似，但保守性低于后者，尤其其启动子-35 区保守性更差并且在大多数谷氨酸棒杆菌基因转录过程中仅仅起很小的作用［10］。因此，筛选谷氨酸棒杆菌强启动子显得尤为困难。Holatko 等发现谷氨酸棒杆菌中苏氨酸脱水酶基因的突变启动子P-ilvEM6 比野生型启动子P-ilvE 转录活性更强，二者的差别在于它们的延伸的-10 区［11］。大肠杆菌表达载体使用的tac强启动子在谷氨酸棒杆菌中并不具有强转录活性［12］。在前期工作中，为了构建谷氨酸棒杆菌高效表达载体，本试验将tac 启动子的-10 区序列（tataat）更换为P-ilvEM6 的延伸的-10 区序列（tgtggtaccatgt），获得了能在谷氨酸棒杆菌中高效表达的异源强启动子tac-M［13］。目前，鲜有谷氨酸棒杆菌天然强启动子鉴定的报道。本研究拟通过对C. glutamicum ATCC13032 菌株细胞全蛋白进行二维电泳和质谱分析，选取高表达蛋白基因进行启动子鉴定，以期获得强启动子序列，为谷氨酸棒杆菌代谢工程育种及重组蛋白生产研究提供基因高效表达调控元件。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、引物及细菌生长条件

本研究所使用的菌株、质粒见表1，寡核苷酸链、引物见表2。大肠杆菌菌株在LB 培养基（5 g/L 酵母膏、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/LNaCl，pH7.0）中以 220 r/min 和37 ℃生长，或在LB 琼脂平板上于37 ℃ 生长。谷氨酸棒杆菌在LBHI 培养基（2.5 g/L 酵母膏、5 g/L 胰蛋白胨、5 g/LNaCl、18.5 g/L 脑心浸液，pH 7.0）中以200 r/min 和30 ℃的温度生长，或在LBHI 固体培养基上在30 ℃的温度生长。全合成培养基（2.5 g/L 葡萄糖，7 g/L (NH4)2SO4、0.5 g/LK2HPO4、200 µg/L 生 物 素、200 µg/L 维 生素B1、0.5 g/L KH2PO4、0.5 g/LMgSO4·7H2O、 4.2 mg/LMnSO4·H2O、6 mg/LFeSO4，pH7.0）仅用于进行全细胞蛋白二维电泳的谷氨酸棒杆菌的培养。如果需要，使用的卡那霉素的终浓度为50 μg/mL。

表1 本研究所用的菌株和质粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

续表：

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 谷氨酸棒杆菌全细胞蛋白的二维电泳和质谱分析

全合成培养基培养C. glutamicum ATCC13032菌株，绘制其生长曲线，确定细胞对数生长中期为细胞收获时间点。收获谷氨酸棒杆菌细胞沉淀后，将细胞沉淀干冰冷冻条件下送至上海生工公司进行全细胞蛋白的二维电泳和质谱分析。步骤如下：首先，提取细胞全蛋白，进行二维电泳；然后，SDSPAGE 胶上选择出若干高丰度表达的蛋白斑点，将其混合在一起进行蛋白质胶内降解；第三步，对蛋白质进行质谱分析鉴定其氨基酸序列；最后，结合C. glutamicum ATCC13032 全基因组注释信息进行蛋白质鉴定。

1.3 混合鉴定的高表达蛋白质与蛋白斑点的匹配

首先采用蛋白质分子量在线预测软件（http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html） 获 得 鉴 定 的高表达蛋白质的分子量以及等电点信息；然后，根据蛋白质分子量以及等电点信息，将其与二维电泳SDS-PAGE 胶上选取的蛋白斑点进行匹配，确定鉴定的高表达蛋白质所对应的凝胶斑点位置。

1.4 蛋白质基因启动子的预测

使用启动子在线预测软件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）对已筛选得到的高表达蛋白质的编码基因起始密码子的上游区域的DNA序列进行启动子预测。

1.5 目的启动子DNA 片段的制备

使用天根生化科技有限公司（北京）细菌基因组提取试剂盒提取C. glutamicum ATCC13032 基因组DNA。应用寡核苷酸链退火法制备启动子DNA片段。寡核苷酸链序列P0864-F 和P0864-R 用于制备启动子P0864 DNA 片段，Ptac-M-F 和Ptac-M-R用于制备启动子tac-M。50μL 退火反应体系包括1μL 正向寡核苷酸链（20 μmol/L），1μL 反向寡核苷酸链（20 μmol/L）。混合物首先在94℃温育5 min，然后80 ℃退火10 min，自然冷却至室温。

1.6 DNA 的提取及重组启动子探测载体构建

使用天根生化科技有限公司（北京）的质粒小提试剂盒及提取质粒DNA。用BamH I 和Hind III消化启动子P0864 和Ptac-M，并分别连接至同样被BamH I 和Hind III 消 化 的pDXW-11 转 化E.coli 感受态细胞，E.coli 感受态细胞的制备和质粒转化依照Sambrook 等的方法进行［15］。通过DNA 测序证实启动子序列的正确插入，重组质粒命名为pDXW-11-P0864 和pDXW-11-Ptac-M。

1.7 谷氨酸棒杆菌转化质粒转化

谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备和质粒转化依照Xu 等的方法进行［16］。重组启动子探测载 体pDXW-11-P0864 和pDXW-11-Ptac-M 转 化C.glutamicum ATCC13032，获得的转化子命名为C.glutamicum/pDXW-11-P0864 和C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M。

1.8 谷氨酸棒杆菌启动子强度分析

1.8.1 谷氨酸棒杆菌氯霉素耐受性的实验观察 C.glutamicum ATCC13032、C.glutamicum/pDXW-11-P0864 和C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M 在不同氯霉素浓度LBHI 平板培养基上的菌落生长的情况，初步比较不同启动子转录活性的强弱。

1.8.2 重组谷氨酸棒杆菌氯霉素乙酰基转移酶CAT活性测定 离心收集50 mL 培养液细胞沉淀，用0.08 mmol/LTris-HCl（pH 7.0）缓冲液洗涤，离心后重悬于1 mL 上述缓冲液，冰上进行细胞超声破碎，12 000 r/min，4 ℃离心获得上清粗酶液。依照Shaw的方法对上清液进行氯霉素乙酰转移酶活性测定［17］。测定混合物（1 mL）包含90 mmol/LTris-HCl（pH 7.8），0.09 mmol/L 乙 酰 基CoA，0.36 g/L 5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸，0.25 mmol/L 氯霉素和粗提取物。在412 nm 和37 ℃下以光度法测量游离的 5-硫-2-硝基苯甲酸酯的形成。一个活力单位定义为：每分钟乙酰化1 µmol 氯霉素所需的酶量。使用牛血清白蛋白作为标准品，使用Bradford 分析试剂盒测定蛋白质浓度。

1.8.3 实时荧光定量PCR 收集对数生长期的菌体，按照CW BIO Ultrapure RNA Kit 试剂盒操作说明提取谷氨酸棒状杆菌总RNA。琼脂糖凝胶电泳验证抽提的RNA 是否符合实验要求，同时用酶标仪定量RNA 浓度。按照苏州宇恒生物公司的US EVERBRIGHT 反转录试剂盒操作说明将mRNA经两步反应反转录生成cDNA。使用2X Super EvaGreen Master Mix（US EVERBRIGHT） 和CFX96 实时PCR 检测系统（Bio-Rad）进行实时荧光定量PCR。每次反应都设阴性对照和标准品校正，基于3 个生物学重复和3 个技术重复，以保证实验数据的有效性。反应完毕根据熔解曲线分析PCR 产物的特异性。16S rDNA 作为内参基因［18］，将不同菌株所得的CT 值差异记做ΔCt 值，将报告基因的氯霉素乙酰基转移酶表达水平标准化为16S rRNA基因的水平，后者用作内源性对照。采用Livak 等的2-ΔΔCt方法处理数据［19］，最终得到两种菌株氯霉素乙酰基转移酶基因的转录水平。

2 结果与分析

2.1 高表达目标蛋白的确定

使用全合成培养基，收获对数生长中期谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032 细胞，提取细胞全蛋白，进行二维电泳，结果如图1 所示。

图1 谷氨酸棒杆菌全细胞蛋白二维电泳图Fig. 1 The two-dimensional gel electrophoresis of the whole protein of the C. glutamicum cells

对混合的45 个蛋白凝胶点（红线圈注）所含蛋白质进行质谱分析鉴定，结合谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum ATCC13032 全基因组注释，鉴定混合凝胶点所包含的蛋白质种类，并分析这些蛋白质的分子量MW 以及等电点pI。图1 中箭头指示的MW 大小约为30 kD，pI 约为4.6 的斑点，其染色颜色深，选之用来鉴定强启动子。对鉴定的蛋白与所选斑点进行匹配分析，结果发现6 种蛋白质理论上的二维电泳位置与斑点相匹配，其分别为PyrF(MW, 28.9 kD; pI, 4.8)、TrpA (MW, 29.1 kD; pI, 4.6)，Cgl0864 (MW, 30.1kD; pI, 4.6)、Cgl2745 (MW, 29.8 kD; pI, 4.8)、Cgl2259 (MW, 29.9 kD; pI, 4.6)、 Cgl1290 (MW, 29.0 kD; pI, 4.7)。因 为PyrF 和TrpA分别是Pyr 蛋白家族和Trp 蛋白家族里的单个蛋白，他们的转录启动受到多个转录元件调控，很难找到最关键的启动子元件。综合考虑，最终选取Cgl0864、 Cgl2745、Cgl2259 和Cgl1290 蛋白编码基因启动子的预测。

2.2 Cgl0864、Cgl2745、Cgl2259 和Cgl1290 基 因的启动子预测

在线预测软件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/ promoter.html） 在0.6 分 的 水 平 上 未 预 测 出Cgl2745、Cgl2259 和Cgl1290 基因的相应启动子序列。Cgl0864 基因开放阅读框架（Open reading frame, ORF）使用GTG 为起始密码子，TAG 为终止密码子，共855 bp，其预测的启动子序列为gtgttt gcgaaagtagtgctagactattcgaaaatcgcaggctgacatcc，如图2 所示，命名为P0864。

图2 谷氨酸棒杆菌ATCC13032 Cgl0864 基因ORFFig. 2 The gene Cgl0864 ORF of C. glutamicum

2.3 谷氨酸棒状杆菌工程菌株C. glutamicum/pDXW-11-P0864 和C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M 的构建

寡核苷酸链退火法制备的P0864 和Ptac-M启动子DNA 片段，分别克隆到启动子探测载体pDXW-11 上，转化谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC13032，提取转化子重组质粒，对其进行单酶切验证，结果如图3 所示，所获质粒大小与预期值一致，工程菌株C. glutamicum/pDXW-11-P0864 和C. glutamicum/ pDXW-11-Ptac-M 构建成功。

图3 谷氨酸棒杆菌重组质粒的单酶切验证Fig. 3 Identification of the recombinant plasmids from C. glutamicum by single restriction enzyme-digestion

2.4 谷氨酸棒杆菌启动子P0864 的活性检测

菌株C. glutamicum ATCC13032、C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M 和C. glutamicum/pDXW-11-P0864氯霉素耐受性试验结果表明，三者的氯霉素耐受性依次为3、30 和 40 μg/mL。报告蛋白CAT 氯霉素酰基转移酶活性检测结果表明，C. glutamicum/pDXW-11-P0864 和C. glutamicum/ pDXW-11-Ptac-M 细 胞上清粗酶液CAT 蛋白比活力分别为4.50 和6.12 U/mg，结果如图4。

图4 谷氨酸棒杆菌中不同启动子控制下表达cat 基因蛋白比活力检测Fig. 4 Activity of the cat gene protein expressed under the control of different promoters in C.glutamicum

通过荧光定量PCR 试验来直接比较菌株C. glutamicum/pDXW-11-P0864 和C. glutamicum/ pDXW-11-Ptac-M 中氯霉素乙酰基转移酶基因cat 转录水平，结果表明，cat 基因在启动子P0864 的控制下，其转录水平是在Ptac-M 控制下转录水平的1.84 倍，结果如图5。

图5 谷氨酸棒杆菌中不同启动子控制下cat 基因表达水平的荧光定量PCR 检测Fig. 5 Transcriptional levels of the cat gene under the control of different promoters in C. glutamicum by real-time quantitative PCR

3 结论与讨论

本研究中对谷氨酸棒杆菌细胞全蛋白进行了二维电泳和质谱分析，选择高表达蛋白进行了强启动子分析和鉴定。以前期实验验证的在谷氨酸棒杆菌中能高效表达的强启动子Ptac-M 为参考，对谷氨酸棒杆菌工程菌株氯霉素耐受性及报告蛋白氯霉素酰基转移酶活性进行检测，结果表明Cgl0864 基因启动子P0864 转录活性强于强启动子Ptac-M。荧光定量PCR 试验结果直接体现了P0864 启动子控制下的cat 报告基因转录水平显著高于Ptac-M 控制下的cat报告基因转录水平。这些结果充分证明了谷氨酸棒杆菌Cgl0864 基因启动子P0864 是一个强启动子。

因谷氨酸棒杆菌基因启动子结构的低保守性［10］，先预测基因组上强启动子再进行活性鉴定的方法，不适合用来筛选谷氨酸棒杆菌强启动子。本研究采用谷氨酸棒杆菌全细胞蛋白二维电泳高表达斑点所匹配的蛋白质基因为研究对象，大大提高了强启动子筛选的靶向性。与本研究所选取的高表达斑点相匹配的蛋白编码基因共6 个，其中pyrF 是5-磷酸乳清苷脱羧酶编码基因，其与氨甲酰磷酸合酶编码基因carA、carB 组成carAB-pyrF 操纵元，参与嘧啶的生物合成；trpA 是吲哚甘油磷酸醛缩酶编码基因，其与trpE、trpD、trpC、trpB 基因一起组成trpEDCBA 操纵元，参与色氨酸的生物合成，这2个操纵元启动子都不属于强启动子［20］。Cgl0864、Cgl2745，Cgl2259 和Cgl1290 都是推测的蛋白质编码基因，对其编码区上游序列进行启动子预测，发现除Cgl0864 外的3 个基因都没有预测到相应的启动子序列。基因不能预测出其启动子，主要原因可能有2 种：（1）基因的启动子非常弱；（2）基因属于操纵元的一部分，与其他基因共用启动子。

目前为止，可用于谷氨酸棒杆菌染色体遗传改造的强启动子非常有限，而且其使用的主要强启动子是源自大肠杆菌的异源启动子［9,12］。本研究成功鉴定了具有强转录活性的Cgl0864 基因启动子P0864，这为下一步构建基于二维电泳高表达蛋白的谷氨酸棒杆菌内源性强启动子库奠定了坚实的基础。启动子鉴定以及其活性的研究是分子生物学研究的重要内容，谷氨酸棒杆菌强启动子的鉴定，一方面能够推动对基因表达调控机制的研究，具有重要的理论意义；另一方面，可为谷氨酸棒杆菌代谢工程育种和重组蛋白生产研究提供更加多样化的、具有不同转录活性的基因过表达调控元件。