猪传染性胃肠炎病毒HB-FP 株的分离鉴定 及其S 基因序列分析

袁广富，肖 娜，刘立辉，陈少杰，王 晶，韩 磊，范京惠，左玉柱

（1. 河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2. 河北省定州市农业农村局，河北 定州 073000）

猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属成员猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus，TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病的主要临床特征为严重腹泻、脱水及迅速消瘦，2 周龄以下仔猪死亡率可达100%［1-5］。目前多篇研究报道了TGEV 常与猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、 猪 轮 状 病 毒（Porcine rotavirus，PRV）、猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）等病毒混合感染，给世界养猪业带来了严重的经济损失［6-7］。TGEV 是囊膜病毒，基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约为28.5 kb，病毒主要编码的结构蛋白有纤突蛋白（S）、膜结合蛋白（M）、小膜蛋白（sM）、核衣壳蛋白（N）［8-11］。其中S 蛋白是高度糖基化蛋白，共有A、B、C、D 4 个抗原位点，在不同的分离株之间抗原有一定差异，其中A、B 和D 位点相对保守，S 基因的点突变或缺失对抗原位点的改变，可以造成病毒毒力的变化甚至会逃避特异性抗体的捕捉［12］。S 蛋白不仅是介导病毒入侵机体、细胞融合、组织嗜性等方面的主要结构蛋白，还在刺激机体产生TGEV 中和性抗体并提供免疫保护方面起重要作用［13-16］，所以S 蛋白一直是TGEV 诊断鉴别、分子流行病学调查、基因工程疫苗、遗传变异分析的重要蛋白，开展S 基因的研究对防控TGEV 具有重要意义。

目前，猪传染性胃肠炎主要通过接种疫苗来进行预防控制，但是近年来流行的毒株处在一个毒力和生物学特性不断变异的动态过程中，传统的弱毒苗已经达不到有效抵抗自然流行毒株的效果，尽管在河北地区TGE 时有发生，但是相关的病原分离鉴定及流行毒株的遗传进化关系分析鲜有报道。本试验对从河北地区采集的腹泻仔猪粪便及小肠内容物进行了RT-PCR 检测，利用PK-15 细胞成功分离到1 株猪传染性胃肠炎病毒并对该病毒S 基因进行序列分析，以了解河北省流行毒株的遗传进化关系及序列变异程度，为该地区TGEV 防控及候选疫苗毒株的筛选提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 病料

病料采自河北某猪场临床表现为腹泻的仔猪粪便或小肠内容物，由本实验室保存于-80 ℃。

1.2 细胞与主要试剂

猪肾细胞（PK-15）由本实验室保存。兔抗TGEV 全病毒阳性血清由本实验室制备并保存。pMD19-T 克 隆 载 体、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker 均 购 自宝生物（大连）有限公司；Super GelRed®核酸凝胶染料购自US Everbright®Inc（苏州）；0.25% 胰酶、FITC- 羊抗兔IgG 购自索莱宝公司；DMEM细胞培养基购自GIBCO 公司；Trizol reagent 购自 Invitrogen 公司。

1.3 引物的设计与合成

引物设计参照GenBank 中TGEV（ 登录号DQ201447）基因序列，采用Primer Premier5.0 软件设计1 对扩增TGEV M 基因的检测引物，设计3 对可覆盖S 基因全长的特异性引物，PEDV、PDCoV、PRV 检测引物均由本实验室保存，引物序列见表1，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of all primers

1.4 临床样本中TGEV 的检测

采用Trizol 法提取粪便或小肠内容物中总RNA，反转录后使用TGEV 特异性检测引物进行RT-PCR 扩增，反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36 个循环；72 ℃延伸10 min，使用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，对符合预期的目的条带（396 bp）进行切胶回收。回收产物与pMD19-T 克隆载体连接转化、菌液PCR 鉴定为阳性的样品送去上海生工进行测序。

1.5 病料的处理及TGEV 的分离培养

取临床样品中检测鉴定为TGEV 阳性，PEDV、PDCoV、PRV 为阴性的样品，加入PBS 反复冻融3 次，4 000 r/min 离心10 min，分离的上清用0.22 μm 滤膜过滤，收集滤液于-80 ℃保存备用。将处理好的病料接种于长满的单层PK-15细胞上，37 ℃吸附1 h，用DMEM 细胞维持液洗两次，加入5 mL 维持液，于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中继续培养，进行盲传，每天观察细胞病变情况，同时设立空白细胞对照。在第5 代时进行RT-PCR 鉴定。

1.6 TCID50 的测定

将第10 代细胞毒进行10-1～10-7的倍比稀释，每个稀释度做8 个重复，分别接种于PK-15 细胞，同时设置不加病毒的PK-15 细胞做阴性对照，连续培养7 d，统计出现CPE 孔数，按照Reed-Muench法计算细胞毒的TCID50。

1.7 TGEV 分离株的间接免疫荧光鉴定（Indirect immunofluorescence assay，IFA）

将PK-15 细胞接种于24 孔板中，待细胞长到80%左右时，将分离的病毒接种于PK-15 细胞，同时设立未接毒的正常细胞作为阴性对照。接毒24 h后弃去上清，用冰冷的4%多聚甲醛固定20 min；加入0.2% 的 TritonX-100 室温通透10 min，加入5% BSA 室温封闭2 h。以1∶100 稀释的兔抗TGEV 全病毒血清为一抗、1∶100 稀释的FITC-羊抗兔为二抗，进行IFA 鉴定。

1.8 TGEV 分离株S 基因扩增

以F10 代细胞培养物cDNA 为模板，通过上述引物对分离株S 片段进行RT-PCR 扩增，扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。切出目的片段凝胶，按照胶回收试剂盒说明书对目的片段进行回收纯化，将回收产物与pMD19-T 连接并转化，菌液PCR 鉴定为阳性克隆的样品，送到上海生工有限公司测序。

1.9 S 基因序列与氨基酸变异情况分析

根据序列测定结果，利用生物信息学分析软件DNAStar 5.0，将S1 ～S3 片段拼接成完整的S 基因，将所获得的S 基因序列提交到NCBI 进行比对分析，选出有代表性的TGEV 参考毒株S 基因的全基因序列（表2），运用DNAStar、MEGA 等软件进行分析比较，构建基因系统进化树，分析HB-FP 株的序列同源性及氨基酸变异情况。

表2 TGEV 参考毒株及其序列信息Table 2 Rerference strains of TGEV and their sequence information

续表：

2 结果与分析

2.1 病毒的分离与培养

将RT-PCR 鉴 定 为TGEV 阳 性，PEDV、PDCoV、PRV 为阴性的病料（图1）处理后接种于PK-15 细胞，在PK-15 细胞上盲传4 代后出现典型的细胞病变（CPE），主要表现为细胞肿胀、变圆、细胞透光性增强、细胞界限不清晰、大片细胞脱落并出现拉网现象，随着代次的增加，细胞出现CPE的时间逐渐缩短，并从第10 代开始CPE 出现的时间及形态逐渐稳定（图 2）。对F5 代细胞毒培养物上清提取RNA，RT-PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，可扩增出与预期大小一致的目的片段。

图 1 病料PCR 扩增结果Fig. 1 PCR amplification of feces

图 2 PK-15 细胞感染第10 代细胞毒产生的细胞病变（100×）Fig. 2 CPE on PK-15 cells incubated with HB-FP (10th passages)（100×）

2.2 TCID50 的测定

将TGEV 分离株连续传代，并将第10 代毒接种于PK-15 细胞，连续培养7 d 后，统计出现CPE 孔数，根据Reed-Muench 法计算得到第10 代毒TCID50为10-5.5/0.1 mL。

2.3 TGEV 分离株的间接免疫荧光鉴定

将分离的TGEV 毒株接种于PK-15 细胞，利用IFA 方法对病毒感染的PK-15 细胞进行间接免疫荧光鉴定，未接毒的正常PK-15 细胞作为阴性对照。结果表明，TGEV 分离株感染细胞后可以与TGEV兔源全病毒血清发生特异性结合，出现特异性免疫荧光，而对照组则没有出现荧光（见图 3）。

图3 HB-FP 株感染PK-15 细胞的间接免疫荧光鉴定Fig. 3 Identification of the isolate HB-FP in PK-15 cell by IFA

2.4 TGEV 分离株S 基因的扩增及序列测定

对分离的TGEV HB-FP 株S1、S2、S3 基因片段进行RT-PCR 扩增，PCR 产物经琼脂糖凝胶鉴定，结果显示，出现与预期片段大小相符的条带。对目的片段胶回收后进行连接转化，菌液PCR 鉴定正确的重组菌进行测序，S 蛋白测序结果已上传至NCBI GenBank 中，登录号MN548093。

2.5 TGEV HB-FP 株S 基因序列与氨基酸变异情况分析

利 用DNAStar 中 的MegAlign 软 件， 参 考GenBank 中已经公布的具有代表性的国内外TGEV毒株与本试验分离到的HB-FP 株S 基因序列进行比较分析。分离株S 基因与参考株S 基因核苷酸和氨基酸的同源性对比分析结果显示，与参考毒株核苷酸同源达到94.9% ～98.8%，氨基酸同源性达到65%～98%，且与我国分离的TGEV JS2012（KT696544)）株核苷酸同源性最高为98.8%，氨基酸同源性为98%，再次印证本次试验分离的毒株为TGEV。HB-FP 分离株S 基因系统进化树显示，整个进化树分为2 个分支，英国的分离株TGEV（AF104420）单独在1 个分支，剩下的25 株分离毒株在另外1 个分支，包括本次分离的HB-FP 株，其中中国的TGEV JS2012（KT696544)）株、美国的TOY56-165（M94103）株、韩国的TGEV（AF298211）株与分离株HB-FP 亲缘关系最近（见图4）。

使用MegAlign 对拼接完整的S 基因进行氨基酸序列分析，发现HB-FP 株与核苷酸同源性最高的TGEV JS2012 株存在22 处氨基酸点突变。分离株与常用的疫苗株存在21 处氨基酸点突变，其中有7处点突变在S 蛋白的抗原表位区，分别是C 抗原位点区域发生的1 处氨基酸位点突变48（P →S），B抗原位点区域发生的2 处氨基酸位点突变分别是97（W →S）、100（R →K），D 抗原位点区域发生的2 处氨基酸位点突变分别是378（V →A）、389（I →M），A 抗原位点发生2 处氨基酸位点突变分别为第542（S →N）、562（N →H）的突变。

图4 HB-FP 分离株S 基因系统进化树分析Fig. 4 Phylogenetic trees of TGEV HB-FP strain based on the S gene

3 结论与讨论

TGE 最早于1946 年在美国首次被报道，随后世界上多个国家相继发生和流行，近年来已经成为我国引起猪群腹泻的重要病原，给养猪业造成了严重的经济损失［1,2,17,18］。虽然疫苗在TGE 的防控中发挥了重要作用，但是越来越多的猪场在使用TGEV疫苗后TGE 仍然会发生和流行，这与新的流行野毒株不断出现，毒株不断发生抗原性变异密切相关。

本试验取河北省某猪场仔猪粪便及小肠内容物进行RT-PCR 检测，利用PK-15 细胞进行分离培养，盲传4 代后出现细胞病变，而且随着传代次数的增加出现细胞病变的时间以及形态逐渐稳定，通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定、基因序列测定，证实分离到的病毒为TGEV，并命名为HB-FP 株。通过引物设计成功扩增出S 基因片段，得到与预期片段大小一致的S 基因组片段（4 350 bp），共编码1 450 个氨基酸。为了解河北省流行毒株的遗传变异情况，本试验将扩增出的HB-FP 株S 基因序列与国内外流行参考毒株序列进行同源性比对并构建遗传进化树，同源性比对结果显示，虽然TGEV S 基因一直是处在一个不断遗传演化过程中，但是没有出现大片段缺失或者是插入的情况。遗传进化关系表明HB-FP 株与除英国外的参考毒株都在同一分支上，其中与中国的TGEV JS2012 株亲缘关系最近。氨基酸变异情况分析表明，虽然HB-FP 株与我国分离的TGV JS2012株同源性最高，但是其核苷酸的点突变导致22 处氨基酸的突变，这些突变对 S 蛋白的免疫原性以及病毒致病力是否产生影响，还有待进一步的研究。分离株与常用的疫苗株相比存在21 处的氨基酸点突变，其中有7 处点突变发生在S 蛋白的抗原表位区，相关研究表明TGEV S 蛋白的抗原位点中氨基酸的突变会影响病毒受体结合或中和抗体相互作用，从而影响病毒的抗原性，本研究中A、B、C、D 位点都产生了氨基酸突变，势必会影响S 蛋白诱导机体产生中和抗体的重要能力，进一步影响到现有疫苗的保护效果，也印证了在遗传进化关系中看到的分离株与常用的疫苗毒株亲缘关系较远，这提示若还是应用经典毒株制成疫苗将不可能为猪群传染性胃肠炎变异株感染提供较好的保护效果，这也将是导致猪群免疫失败的原因之一。如果这些变异的野毒株不能够引起大家足够的重视，这将对现有的猪群防控措施制定以及养猪业的健康持续发展都会带来不同程度的负面影响。

本试验成功分离鉴定了1 株河北省猪传染性胃肠炎病毒并对该病毒S 基因进行序列分析，为了解河北省TGEV 流行毒株的遗传进化关系提供了有力依据，为河北地区TGEV 流行变异株疫苗的制备以及深入研究TGEV 流行变异株的致病机理奠定了基础。