掌叶半夏开花特性及繁育生物学研究

张 庚，张笑玲，孟义江，靳小莎，李 会，葛淑俊

（1.河北农业大学 农学院/华北作物种质资源教育部重点实验室，河北 保定 071000； 2.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000）

掌叶半夏（Pinellia pedatisecta Schott），又名虎掌，是天南星科（Araceae）半夏属（Pinellia）多年生草本植物，以干燥块茎入药，有祛风止痉、化痰散结、降逆止呕、消痞散结的功效，抗肿瘤，抗惊厥，对中枢系统有影响，药用历史久远［1］。

掌叶半夏作为历代药用天南星的正品优质药材来源，已在全国大面积栽培［2］，陕西汉中地区有悠久的栽培历史，江苏宿迁县年栽培面积也较大，河北安国是古冀州虎掌的老产区，也有大面积种植［3］。但多年来掌叶半夏相关工作主要集中于栽培管理、临床应用和化学成分上［4-6］，在种质资源和遗传育种等方面研究薄弱，关于掌叶半夏的开花物候和繁育系统尚未见报道。

植物的传粉机制和交配系统受花部形态、开花物候和花序结构的影响［7-8］，其花部形态和交配系统是繁育系统的核心。植物的繁育系统从异花授粉进化为自花授粉是一个普遍的进化转折［9］。由于近交衰退的存在，植物已经进化出各种方法避免自交。因此，严格自交的植物很少见。到目前为止所能查到的物种的繁育系统的数据表明，大多数异花授粉植物可以自花授粉，大部分自花授粉植物也可以异交，即混合交配系统在自然界中广泛存在［10-11］。

本研究以掌叶半夏栽培种为材料，通过调查开花物候规律、测定花粉活力和柱头可授性、人工控制授粉统计结实率等研究揭示该植物的繁育系统类型，以期为种子繁育和杂交育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

掌叶半夏块茎购自河北省安国市中药材种子市场，经安国市科技局叩根来高级农艺师鉴定为掌叶半夏（Pinellia pedatisecta Schott）。

1.2 试验方法

试验于2015—2017 年在河北农业大学教学试验场进行。将掌叶半夏块茎晾晒后栽种。每亩（667 m2）施1 000 kg 充分腐熟的农家肥，深翻整地耙平，按行距30 cm 开沟，将块茎按株距10 cm 摆放，芽头冲上。覆土5 cm 左右。其余管理同大田。

1.2.1 掌叶半夏花部特征及开花物候观察 掌叶半夏的开花物候观察从佛焰苞出土开始持续到果实成熟结束。在散粉前，选取30 株佛焰花序挂牌标记，测量雄花序和雌花序直径、花序柄和附属器长度、柱头和花药的空间位置，记录佛焰苞各部分的颜色和结构。将子房明显膨大作为坐果标志，将果实自然落地作为果实成熟标志。

1.2.2 花粉活力的测定方法 采用TTC 法、I2-KI 法、MTT 法和离体萌发法分别对掌叶半夏花粉活力进行测定［12］。使用添加不同浓度蔗糖和硼酸的改良BK基本培养基进行离体培养花粉。基本BK 培养基组成为：100 mg/L H3BO3, 300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O, 200 mg/L MgSO4·7H2O, 100 mg/L KNO3和10% 蔗糖 (w/v)。

离体萌发法试验中，蔗糖设4 个浓度(5%、 10%、 15%、 20%, w/v)，硼酸设4 个浓度(50、100、250、500 mg/L, w/v; 表3 )，每个浓度3 次重复。离体萌发法培养条件：33℃恒温培养箱，培养5 h后在10×显微镜下观察，以花粉管长度大于花粉粒直径为萌发标准［13］，记录萌发花粉数和未萌发花粉数，计算萌发率。

萌发率（%）= 每个视野中萌发花粉数/花粉总数×100%

观察3 个不同视野，取平均值。

化工技能型人才培养模式研究与实践…………………………………………周西臣，马 勇，蒋秀燕，徐 鸣，于颖敏（2.71）

1.2.3 不同开花天数花粉活力的测定 对花药尚未开裂的花序进行标记，分别在散粉第1 天、第2 天、第3 天、第4 天收集花粉，采用1.2.2 离体萌发法测定花粉活力，试验重复3 次。

1.2.4 柱头可授性检测 采用联苯胺—过氧化氢法(1% 联苯 胺∶3%H2O2∶水=4∶11∶22，v/v)［14］。收集不同时期的柱头，相同时期的柱头每5 个为1 组，重复3 组。若柱头周围的反应液呈现蓝色并有大量气泡出现，则柱头具可授性，气泡数越多表明柱头可授性越强。

1.2.5 繁育系统检测 按照Amots Dafni［15］的标准进行掌叶半夏花序直径、花朵大小和开花行为的测量和繁育系统的评判。具体方法是：（1）花朵或花序直径＜ 1 mm 记为0，1 ～2 mm 记为1，2 ～ 6 mm 记为2，＞ 6 mm 记为3；（2）花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔，同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1；（3）柱头与花药的空间位置，同一高度记为0，空间分离记为1。三者之和为OCI值。评判标准为：OCI = 0 时，繁育系统为闭花受精；OCI = 1 时，繁育系统为专性自交；OCI = 2 时， 繁育系统为兼性自交；OCI = 3 时，繁育系统为自交亲和，有时需要传粉者；OCI = 4 时，繁育系统为异交为主，部分自交亲和且需要传粉者。测量花序直径，记录花药开裂和柱头可授性的时间、花药和柱头的空间距离。

按 照Cruden［16］的 标 准 进 行 花 粉 胚 珠 比(Pollen-ovule ratio，P/O)的估算。随机选取30 株未开放的花序，将单个花序的所有花药放入300 μL 95%硫酸中裂解5 d(25 ℃)，取1 μL 放在载玻片上在10×显微镜下计数花粉数，计算平均值。每个花序的花粉量等于1 μL 中花粉数的平均值乘以300。每个花序的胚珠数等于每个子房的胚珠数乘以每个花序的子房数。

人工授粉测定掌叶半夏繁殖方式的试验按照表1 所示5 种方式进行，每种方式各标记30 个花序，授粉后20 d 左右统计结实情况。

表1 人工授粉套袋试验的不同方式Table 1 Treatments used in the breeding system

2 结果与分析

2.1 掌叶半夏花部形态及开花物候

掌叶半夏是多年生草本单子叶植物，在半夏属中拥有最大的块茎和花序。其花序为肉穗花序，整个花序为绿色( 图1 D)，花序柄长201.1±34.0 mm(n=30,下同)。佛焰苞上下分为檐部和管部，无隔膜，管部长圆形向下渐收缩，檐部长披针形，锐尖；雌雄同株，花单性，无花被。雄花序在上，黄白色或略带紫红色，圆柱形，直径3.7±0.5 mm；药室顺肉穗花序方向伸长，顶孔纵向开裂，成熟花粉呈黄白色(图1 E)。雌花序在下，与佛焰苞管部合生，雌花序直径4.4±0.5 mm，绿白色(图1 E)，单侧着花；雌蕊柱头呈雪白色，帽状，子房卵圆形，1 室，1 胚珠。附属器黄绿色细线形鼠尾状，长150.2±25.1 mm，直立或略呈“S”形弯曲，超出佛焰苞很长。

掌叶半夏群体开花持续期较长，从5 月到8 月陆续有花序抽出、开放散粉，就单个花序而言，佛焰苞出土后8 ～10 d 花药开裂散粉，14 ～16 d 雄花序凋谢(15.3±0.66 d)。35 d 左右果实成熟。

根据掌叶半夏佛焰苞发育的特点将其划分为8个阶段见表2，对应的发育阶段见图1。

表2 掌叶半夏佛焰苞动态变化Table 2 Dynamic development of spathe in P. pedatisecta

图1 掌叶半夏佛焰苞从出土到果实成熟的发育变化Fig.1 Development from spathe emergence to fruits maturity in P. pedatisecta

2.2 花粉活力测定方法的确定

通过4 种方法对掌叶半夏花粉活力进行检测，结果发现，经TTC 法、I2-KI 法和MTT 法染色后，花粉染色效果不佳，颜色差异不明显，无法分辨统计出花粉活力；采用离体萌发法，花粉离体均可以萌发，可以较准确分辨统计花粉活力。因此，选择离体萌发法进行掌叶半夏花粉活力测定并研究了蔗糖和硼酸浓度对花粉萌发的影响（表3）。结果表明，蔗糖和硼酸在不同程度上对花粉萌发起作用，蔗糖硼酸组合(10%, 100 mg/L)的花粉萌发率与其它组合(5%, 100 mg/L), (10%, 250 mg/L), (15%, 100 mg/L)没有显著差异(P=0.01)，并且这4 组显著高于其它12 组处理(P=0.01)，是较优组合。然而，蔗糖硼酸组合(5%, 100 mg/L), (15%, 100 mg/L)中花粉管萌发较短，组合(10%, 250 mg/L)出现花粉管严重破裂，只有(5%, 100 mg/L)花粉管较长没有破裂且较清晰。所以最适宜硼酸浓度为100 mg/L，蔗糖浓度为10%，花粉萌发达到最大值73.56%。

表3 蔗糖、H3BO3 对花粉萌发率的影响Table 3 Effects of sucrose and H3BO3 on the germination rate

2.3 不同开花天数花粉活力检测结果

从散粉开始每天采集掌叶半夏花粉，采用离体萌发法测定花粉活力，结果见图2。从总体上看，不同天数的花粉活力呈现出先上升后下降的趋势。掌叶半夏散粉当天花粉活力为69.64%，花粉量较少；随着雄花序的逐渐发育，更多的花粉粒成熟，花药散开，有活力的花粉数量增加、活力不断增强，到散粉第2 天，花粉活力达到最高，为73.87%，同时花粉量最多；散粉第3 天花粉活力开始下降，第4天下降幅度较大，花粉活力仅为29.71%。因此在杂交时选择散粉第二天的花粉授粉受精效果更好。

图2 掌叶半夏不同时期的花粉活力Fig.2 Pollen viability of P.pedatisecta in different periods

2.4 掌叶半夏柱头可授性检测结果

利用联苯胺—过氧化氢法进行柱头可授性的检测结果见表4。掌叶半夏的柱头可授性与佛焰苞的发育阶段有关，事实上，在附属器还没伸出佛焰苞之前柱头就已经具有微弱的可授性（表4）。当附属器逐渐伸出佛焰苞，柱头可授性也逐渐加强。从佛焰苞上檐打开到散粉当天柱头可授性最强，之后一直保持相对较高的可授性，到第4 天仍没有接受到花粉则活力开始下降，至第6 天活力完全丧失。而接受花粉后第2 天柱头活力即开始下降，第3 天则完全失去可授性。因此进行杂交授粉时，要在柱头具有较高可授性时授以高活力花粉，以保证良好的结实率。掌叶半夏柱头活力检测情况见图3。

表4 不同时期掌叶半夏柱头可授性Table 4 Sigma receptivity of P. pedatisecta from different stages

图3 掌叶半夏不同时期柱头可授性Fig.3 Sigma receptivity of P. pedatisecta in different stages

2.5 掌叶半夏的繁育系统检测结果

花器结构分析表明，掌叶半夏花序直径为4.45±0.86 mm，小于6 cm，记为2；两性花的花药与柱头空间有分离，花药位置高于柱头(1 ～1.5 mm)，记为1；柱头在散粉前即具有可授性时，即柱头可授期与花药开裂时间有时间间隔，记为0。掌叶半夏OCI 值为3。掌叶半夏的繁育系统为自交亲和，有时需要传粉者。

掌叶半夏花粉胚珠比的检测结果为，每个花序的花粉量为33 166.7±2 565.1 粒，胚珠数为56.7±2.2 个，因此P/O 值 为587.2±67.9。当P/O值为244.7 ～2 588.0 时，根据Cruden 的标准，掌叶半夏属于兼性异交。

本研究对不同授粉方式下掌叶半夏结实率进行了估算，结果表明授粉方式不同，掌叶半夏结实率有显著差异（图4）。不进行任何处理的自然授粉结实率为91.4%；去雄后直接套袋而不授予花粉时结实率为0，表明掌叶半夏不存在孤雌生殖现象；不去雄直接套袋进行自花授粉结实率为80.47%，表明掌叶半夏自交亲和；去雄授以异花花粉后结实率最高（92.0%），表明掌叶半夏异交亲和，易于接受外来花粉完成受精过程，揭示了人工授粉有助于提高种子产量。而去雄后不套袋后进行异花授粉结实率为5.48%，则表明掌叶半夏自然异交率很低，属于常异花授粉植物。

图4 授粉方式对掌叶半夏结实率的影响Fig.4 Fruit set ratio under five pollinating treatments for P. pedatisecta

3 讨论

花序的结构在空间和时间上强烈地影响着自然群体的杂交水平。无限花序比如伞状花序，通过延长花期以便获得种群个体间更多的杂交，从而提高坐果率，获得更多的繁衍机会［17］。如红白忍冬为聚伞花序，单花开放时间短，但整个花序是无限生长，陆续开花的习性使得植物体获得了较多的杂交机会。因此尽管自交亲和力较弱，但异花授粉结实性较好［18］。掌叶半夏花序为天南星家族特有的结构—佛焰花序，其特点也是掌叶半夏为常异花授粉植物的根本原因。首先，佛焰苞绿色，没有丰富多彩的颜色吸引传粉者。尽管在试验中观察到了苍蝇、蚂蚁、红蜘蛛等昆虫，但不能确定是否具有传粉行为。就自然异交率(5.48%)来说，他们有可能是传粉者。当传粉受限时，天南星科某些植物中出现自花授粉来确保结实繁育后代，因此，为了确保产生种子，植物进化出了自花授粉机制［19］。

另外，掌叶半夏雌花序比雄花序先成熟是一种异花授粉的机制，但实际上当佛焰苞打开后只有雄花序露在佛焰苞外面，雌花序在佛焰苞里面，外来花粉不容易到达。此外，自花授粉概率很高，因为花药开裂和柱头具有可授性时期在时间上重叠。就人工自花授粉的自交率(80.47%)和杂交指数来说，掌叶半夏是自交亲和的。花药在柱头正上方1 ～3 mm， 花药开裂后花粉极容易自然掉落到自身柱头上，完成受精。综上所述，佛焰苞结构有助于自花授粉，尽管具有部分异交机制(雌花序先熟)。

Cruden［16］在研究80 个不同植物后得出结论，花粉胚珠比是表征繁育系统特征值。这样，花粉胚珠比就作为研究植物繁育系统的有效工具。目前，花粉胚珠比还局限在研究双子叶有花植物，对单子叶植物研究较少，尤其是对拥有佛焰花序的天南星科植物。天南星科有105 属，3 300 多种植物，其繁殖机制也是多种多样的［20-21］。

目前还尚未见有关掌叶半夏花粉胚珠比的报道。本研究不同授粉处理结果表明，掌叶半夏可以自交也可以异交，即兼性异交，与花粉胚珠比的结果一致。这表明花粉胚珠比学说可以应用在掌叶半夏物种上。然而，Chouteau［20］在研究天南星科23 个Philodendron 属物种和20 个Anthurium 属物种花粉胚珠比后指出，花粉胚珠比可能与所研究的物种的繁育系统没有直接的联系，因为天南星家族有特殊的传粉机制。此外，半夏与掌叶半夏同属，测定的花粉胚珠比为6 443±777，但是自花授粉能力尚不清楚。Mathieu 在研究天南星科54 个物种的花粉胚珠比后指出，这些物种绝大多数都没有自花授粉能力，其花粉胚珠比变化范围为44 ～42 2107［19］。与此不同的是，本试验揭示掌叶半夏有很强的自花授粉能力。