广东人群中α珠蛋白基因多拷贝频率分布研究

魏小凤 徐湘民 郭晓玲 周玉球 黄烁丹 刘彦慧 陈亚军 丁红梅商璇

1南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室（广州510515），2广东省佛山市妇幼保健院（广东佛山528000），3广东省珠海市妇幼保健院检验科（广东珠海519000），4广东省梅州妇幼保健院（广东梅州514000），5广东省东莞市妇幼保健院产前诊断中心（广东东莞523000），6广东省韶关市妇幼保健院（广东韶关512000），7广东省云浮市人民医院妇产科（广东云浮527300）

alpha 地中海贫血（α-thalassemia 简称α地贫）是一组由于α珠蛋白基因变异使得α-珠蛋白基因表达降低或缺如，致使血红蛋白四聚体组分中的α-链与非α-链的比例失去平衡而引起溶血性贫血的遗传性疾病［1-2］。α地贫是长江以南地区的高发出生缺陷，在南方各省的人群携带率分别为广西19.11%、广东12.7%、贵州9.26%、海南45.04%，云南6.99%［3］。与α地贫基因缺陷相比，α珠蛋白基因多拷贝相对罕见。单纯的α珠蛋白基因多拷贝携带者临床表型并无异常，但是合并β地贫杂合子则引起α与β珠蛋白链失衡从而导致个体患有中间型β地贫，合并β地贫纯合子或双重杂合子则会使患者贫血程度加重［4-8］。中间型β地贫（TI）患者有中度及以上程度贫血，常合并肝脾肿大及轻度黄疸；而重型β地贫（TM）患儿需定期输血并应用铁螯合剂治疗，给家庭和社会带来巨大的经济负担以及沉重的精神压力［9］。如果夫妇中一方携带β地贫杂合，而另一方存在α珠蛋白基因的多拷贝，则他们所生的孩子有1/4 的概率是由β地贫突变杂合子合并α珠蛋白基因簇多拷贝所导致的中间型β地贫［4-8］。由此，了解人群中α珠蛋白基因的多拷贝的分布及携带情况也成为防控地贫的公共卫生需要之一。而此前所有的广东人群地贫流行病学调查都极少涉及到α珠蛋白基因拷贝数增加的分布情况［3，10-16］，为此本研究目的是探讨广东人群中α珠蛋白基因多拷贝的人群携带频率、变异类型及分布特征。

1 对象与方法

1.1 研究对象2015年10月至2016年3月在梅州市妇幼保健院、珠海市妇幼保健院、云浮市人民医院、韶关市妇幼保健院、佛山市妇幼保健院、东莞市妇幼保健院以及东莞市计生所进行婚前/产前检查的广东籍夫妇共2 310 对。

1.2 方法

1.2.1 样本及其数据采集EDTA抗凝管采血2 mL，同时采集夫妇对的个人信息（包括姓名、性别、年龄、籍贯、民族、联系方式等）、地贫表型资料（血红蛋白含量（Hb）；平均红细胞血红蛋白含量（MCH）；平均红细胞体积（MCV）；Hb A2（%）和Hb F（%）以及地贫基因型常规检查结果。所有受试者均签署知情同意书。

1.2.2 NGS 分析DNA 提取试剂盒（美基生物Magen）提取全基因组DNA，使用凝胶电泳和NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific，USA）测量DNA 样品的浓度和纯度。利用HiSeq2000 测序仪（Illumina，USA）进行二代测序，具体测序及分析过程参照已发表文献［3］。

1.2.3 MLPA使用MRC-Holland 公司生产的P140-B4 HBA 试剂盒检测α-珠蛋白基因簇中的拷贝数变异［17］，按照说明书进行操作，MLPA 探针分布见图1A。

1.3 统计学方法计数资料采用构成比表示，计量资料用均数±标准差表示，利用SPSS 16.0 软件对血液学参数指标进行t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本组成选取夫妇双方均为广东籍的夫妇2 310 对，其来源情况和基本信息见表1。

表1 样本组成Tab.1 Sample composition

2.2 表型分析对92 例α珠蛋白基因拷贝数增加的个体及92 例对应地区的正常个体的血液学指标进行统计学分析后发现，两类人群差异均无统计学意义（表2）。

表2 正常个体与单纯α珠蛋白拷贝数增加个体血液学参数对比分析Tab.2 Comparative analysis of hematological parameters between individuals and simples with multiple copies of alpha globin gene±s>

表2 正常个体与单纯α珠蛋白拷贝数增加个体血液学参数对比分析Tab.2 Comparative analysis of hematological parameters between individuals and simples with multiple copies of alpha globin gene±s>

基因型αα/αα αα/ααα P 值Hb（g/L）138.86±17.76 140.26±16.87 0.621 MCV（fl）89.42±4.92 89.68±5.17 0.969 MCH（pg）29.53±1.44 29.68±2.01 0.890 HbA2（%）3.18±0.60 3.16±0.68 0.991

2.3 基因型分析

2.3.1 NGS分析4 620例样本经NGS检测后检出559 例携带α地贫基因，同时检出携带α基因多拷贝样本92 例，合计651 例。4 620 例样本NGS 检测α珠蛋白基因变异结果见表3。

表3 4 620 例样本α珠蛋白基因突变及拷贝数变异结果Tab.3 α globin gene mutation and copy number variation results of 4 620 samples

2.3.2 MLPA 分析对NGS 分析发现的92 例α珠蛋白多拷贝样本，采用MLPA 分析进一步验证。确定92 例 样本中45 例携带αααanti3.7，47 例携带αααanti4.2。α珠蛋白基因拷贝数变异的MLPA 分析图见图1。广东6 个代表性地区的α珠蛋白基因拷贝数增加的分布情况见表4。

表4 广东6 个代表性地区的α珠蛋白基因拷贝数增加的分布情况Tab.4 Distribution of multiple copies of alpha globin gene in six representative regions of Guangdong

图1 代表性MLPA 结果图Fig.1 Representative MLPA results graph

2.3.3 高风险夫妇对由于β地贫杂合子合并α珠蛋白基因多拷贝可导致个体患有中间型地贫。根据NGS 和MLPA 的分析结果，可发现两对传统地贫基因检测方法无法发现的高风险夫妇，其具体情况见表5。由表中可知，这两对夫妇将各有1/4 的风险生出患有中间型β地贫的患儿，其基因型分别为αα/αααanti4.2，β-50/βN 和αααanti3.7/αα，βCD41-42/βN。

表5 NGS 检测多检出的高风险夫妇对Tab.5 new high-risk couples detected by NGS

3 讨论

α珠蛋白基因的拷贝数是影响β地贫的临床表型的重要因素之一。β地贫纯合子或者双重杂合子合并α地贫缺陷可以使患者贫血程度减轻，β地贫杂合子合并α珠蛋白基因三联体或四联体，则会使α/β珠蛋白比例失衡加重，使患者由无临床症状或者轻型变为TI 表型［18-19］。α基因三联体或四联体在大多数人群中携带率不高，但其合并β地贫杂合子引起TI 表型的情况仍值得注意。斯里兰卡进行的一项调查显示，2%～3%的β地贫患者合并α基因三联体或四联体［20］，意大利也曾报道16 例表现为TI 表型的β杂合子中有10 例是合并了α基因三联体的［21］。而在中国人群中β地贫杂合子合并α珠蛋白基因三联体或四联体使得患者表型加重的案例时有报道［5-7］。夫妇中如果一方携带β地贫杂合，而另一方存在α珠蛋白基因的多拷贝，则他们所生的孩子有1/4 的概率是由β地贫突变杂合子并α珠蛋白基因三联体或四联体所导致的TI。由此，α珠蛋白基因多拷贝的诊断成为地贫防控的一部分，人群中α珠蛋白基因的多拷贝的分布情况就成为了防控地贫的公共卫生需要之一。

过往研究显示，单纯α珠蛋白基因拷贝数增加的个体与正常个体血液学表型并无显著差异［4-8］，本研究也发现了类似的结果。所以，通过表型筛查难以发现α珠蛋白基因多拷贝的携带者。既往案例中用于检测α珠蛋白基因多拷贝的方法主要有Southern 印迹杂交技术（Southern blot）［4］、微阵列比较基因组杂交技术（array-CGH）［5，7］、MLPA［5-6，8］以及NGS［3，6，8，22］等。经典的Southern blot 检测周期长，操作繁琐；array-CGH 检测周期中等，成本高，操作复杂；MLPA 价格便宜，检测周期短，可检测特定基因内是否存在拷贝数变异；NGS 通量高，检测费用高，检测周期中等，操作复杂，对全基因组水平拷贝数变异均可检测。因此建议需要进行α珠蛋白基因拷贝数个体检测的可以选择MLPA 技术，而需要进行大人群检测的可以考虑NGS 技术。

目前已报道的α珠蛋白基因多拷贝形式有ααα146kb、ααα204kb、ααα69.4kb、αααanti3.7和αααanti4.2等［3-8，20-21］，其中，中国人群中常见的是αααanti3.7和αααanti4.2。α多拷贝在广西人群中的携带率为1.28%，贵州为1.79%，海南为0.92%，云南为2.25%［3］。从表4 可知α多拷贝在广东人群中的变异类型是是中国人群中最常见的变异类型αααanti3.7和αααanti4.2，携带率是1.99%（92/4 620），广东人群中α珠蛋白多拷贝的携带率在中国南方地贫高发地区中偏高，仅次于云南省。