LASP1在胶质母细胞瘤组织中的表达及其对肿瘤耐药和患者预后的影响

郭张超 陶蓓 夏祥国 陈礼刚 钟传洪

1西南医科大学附属医院神经外科，四川省神经外科临床医学研究中心，四川省院士（专家）工作站（四川泸州646000）；2西南医科大学附属医院风湿免疫科（四川泸州646000）

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，约占胶质瘤的50%，具有致死率高、易复发、预后差等特点[1]，即使经标准化治疗，中位生存时间仍仅14个月左右[2]。肿瘤细胞的快速增殖及对目前治疗的高抗药性是其预后不良的主要原因[3]。因此，寻找影响细胞增殖和耐药关键分子，对开发新的治疗靶点及预后评估具有重要意义。LASP1蛋白（LIM and SH3 protein1）是一种肌动蛋白结合蛋白，近年来发现其在多种恶性肿瘤中上调[4-7]，与肿瘤的发生、增殖、迁移和化学抵抗等密切相关[8-10]。笔者前期基础研究发现LASP1 可能作为GBM的促癌因子，通过PI3K/AKT 依赖性机制参与调节肿瘤的增殖及替莫唑胺耐药[11]。然而，LASP1 对GBM 临床治疗及预后的影响国内外还少有报道。本研究通过免疫组化检测LASP1在140例GBM患者组织中的表达，探讨LASP1在GBM 中的表达及其与患者临床治疗和预后的关系，为GBM 寻找新的治疗靶点提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究标本来源于2012年1月10日至2018年6月30日，西南医科大学附属医院行手术切除并经病理证实的GBM 肿瘤组织。所有患者术前均未经放疗、化疗以及任何其他免疫性治疗，手术均由相同两位高年资外科医生合作完成，且排除患有严重基础疾病、肿瘤无法切除和发生严重并发症者。此外，患者的临床及随访资料相对完整。共收集病例140例，其中男83例，女57例，年龄21～80岁，平均（54.74±12.56）岁，中位年龄54岁；P53 突变检测结果明确者135例。对照组15例标本均取自颅脑外伤需行颅内减压术手术过程中。所有留取组织离体后，立即由病理科高年资医师统一固定、石蜡包埋，于4℃恒温、干燥、避光保存[12-13]。本研究通过西南医科大学伦理委员会批准（伦理编号：K2018010），研究对象术前均签署知情同意。全部140例患者出院后均随访，随访方式为电话随访和门诊随访，末次随访时间为2019年5月6日，随访时间3～50个月，中位随访时间11个月。至随访截止日，存活病例19例，死亡119例，失访2例。

1.2 主要试剂及方法兔抗人LASP1多克隆抗体（美国Abcam公司）；EnVision 免疫组化检测试剂盒（DAKO公司），使用免疫组化Envision 二步法检测LASP1的表达水平。取石蜡标本切片，厚度约4 μm，常规脱蜡至水，枸橼酸钠缓冲液（pH=6.0）高压修复3 min，自然冷却至室温。3.0%甲醇双氧水孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS 缓冲液冲洗3次，每次3 min。加入一抗兔抗人LASP1多克隆抗体（稀释比例1∶500），27℃孵育60 min，PBS 冲洗3次，每次3 min。加入二抗，27℃孵育30 min，PBS 冲洗3次，每次3 min。室温下DAB 显色，镜下控制显色，苏木精复染，稀盐酸分化，饱和碳酸锂反兰，脱水、透明、固定后，显微镜观察，以PBS 代替一抗作为阴性对照组。

1.3 结果判断结果由两位有经验的病理科医师进行双盲阅片，在高倍视野下，每例随机选取5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞。根据染色阳性细胞所占百分比和染色强度累积积分乘积判断结果：（1）按着色强度评分：0分为无染色，1分为弱染色浅黄色，2分为中度染色黄褐色，3分为重度染色棕黄色。（2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：阳性细胞数0%～5%为阴性0分，阳性细胞数＞5%～25%为1分，阳性细胞数＞25%～50%为2分，阳性细胞数＞50%～75%为3分，阳性细胞数＞75%为4 分。染色指数的计算方法如下：染色指数评分=染色强度评分×染色阳性肿瘤细胞比例评分。染色指数评分≤2分为阴性，＞2分为阳性[14]，统计分析时0～7分为低表达，8～12分为高表达。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，计量数据采用（）表示，LASP1与各临床病理参数之间的关系使用χ2检验，Kaplan-Meier 法分析LASP1的表达与生存时间及无复发生存时间关系，应用单因素及Cox 比例风险模型分析影响胶质瘤预后的因素。所有统计结果均以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LASP1在胶质母细胞组织及对照组织中的表达LASP1在胶质母细胞瘤组织中的蛋白阳性表达率为88.6%（124/140），正常脑组织中的阳性表达率为13.3%（2/15），GBM 中LASP1的表达高于正常脑组织，差异有统计学意义（χ2= 54.370，P＜0.01）。见表1、图1。

表1 LASP1在胶质母细胞瘤组织及正常脑组织中的表达Tab.1 Expression of LASP1 in glioblastomas and normal brain tissues例（%）

图1 LASP1在胶质母细胞组织及正常脑组织中的表达Fig.1 Expression of LASP1 in glioblastomas and normal brain tissues

2.2 胶质母细胞瘤中LASP1的表达与临床病理特征的关系χ2检验分析LASP1的表达与患者各临床病理特征的关系，结果显示：性别、年龄、术前KPS评分、肿瘤部位、P53 突变与LASP1的表达无相关性（均P＞0.05），而Ki67的表达、肿瘤大小、囊性改变与LASP1的表达具有相关性（均P＜0.05，表2）。

表2 胶质母细胞瘤中LASP1的表达与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between the expression of LASP1 and clinicopathological features in glioblastoma

2.3 胶质母细胞瘤中LASP1的表达与患者复发、生存时间和替莫唑胺疗效的关系采用Kaplan-Meier 法分析LASP1的表达与患者无复发生存时间、总体生存时间及替莫唑胺疗效的关系。结果显示LASP1 高表达患者的无复中位生存时间为（7.00±0.43）个月，较低表达者（13.00±0.90）个月明显缩短，差异有统计学意义（χ2=44.90，P＜0.01），高表达患者的中位生存时间为（11.00±0.55）个月，较低表达患者（18.00±1.69）个月明显缩短，差异有统计学意义（χ2=48.65，P＜0.01），见图2。同时结果显示替莫唑胺化疗可显著延长低表达患者的中位生存时间[（23.00±2.48）vs.（14.00±1.74）个月，χ2=11.844，P＜0.01]、无复发中位生存时间[（17.00±1.39）vs.（11.00±0.80）个月，χ2=10.372，P＜0.01]，差异有统计学意义；而对高表达患者的中位生存时间[（11.00±0.82）vs.（9.00±1.10）个月，χ2=1.942，P=0.163]、无复发中位生存时间[（8.00±0.79）vs.（6.00±0.36）个月，χ2=2.821，P= 0.093]均无明显改善，差异无统计学意义（图3）。

图2 胶质母细胞瘤中LASP1表达与患者无复发生存时间和总体生存时间的关系Fig.2 The relationship between the expression of LASP1 and recurrence free survival time and overall survival time in glioblastoma

图3 胶质母细胞瘤中LASP1的表达与替莫唑胺疗效的关系Fig.3 Relationship between LASP1 expression and efficacy of temozolomide in glioblastoma

2.4 单因素及多因素分析影响胶质母细胞瘤预后的因素采用单因素分析及多因素Cox 回归分析结果显示，LASP1的表达及替莫唑胺化疗，是影响胶质母细胞瘤预后的独立因素（均P＜0.01），见表3。

表3 单因素及COX多因素分析影响胶质母细胞瘤预后的独立因素Tab.3 Univariate and multivariate analysis were used to analyze independent prognosis factors of glioblastoma

3 讨论

LASP1 作为一种广泛表达的肌动蛋白结合蛋白，随着其结构、调控、功能和表达模式等方面的研究进展，近二十年来LASP1 已经从一种简单的肌动蛋白结合结构蛋白，发展为肿瘤生物标志物[15-16]。越来越多研究表明，LASP1的表达与肿瘤的临床及预后密切相关，是一种有价值的潜在治疗靶点[17-18]。

本研究在前期研究的基础上，采用免疫组化检测了LASP1在GBM 瘤标本中的表达情况，发现LASP1在GBM组织中的表达明显高于正常脑组织，提示LASP1与GBM的发生、发展相关。Ki67是细胞增殖核抗原，在增殖细胞中表达上升[19]，肿瘤大和发生囊性改变多见于肿瘤的快速增殖；在对患者的病例特征分析中发现LASP1表达与Ki67的表达、肿瘤大和发生囊性改变正相关，提示在临床上LASP1 过表达可能促进了GBM 细胞的增殖，与笔者前期研究[11]及LIU 等[20]在胶质瘤中的发现一致。在进一步分析LASP1与患者预后的关系，发现LASP1 高表达患者的复发和总体生存时间较低表达患者显著下降，单因素及多因素分析提示LASP1的表达及替莫唑胺化疗是胶质母细胞瘤预后的独立危险因素，结果表明LASP1的表达与GBM预后相关。目前，GAO等[21]在鼻咽癌中发现LASP1过表达与肿瘤的转移及不良预后相关，通过LASP1/PTEN/AKT 轴可促进肿瘤增殖及迁移，是其潜在治疗靶点；LI 等[22]的研究发现LASP1 过表达促进肝癌的进展，通过miR-133b/LASP1 轴可抑制肿瘤的生长和转移。这与本研究结果相似，说明LASP1在GBM 有可能是潜在治疗靶点及预后标志物。

本研究还发现LASP1的表达升高降低了患者替莫唑胺的疗效，LASP1与患者替莫唑胺敏感性相关。陈祺等[23]在口腔鳞癌中也发现LASP1表达升高可促进多西他赛耐药，其推测与FAK-AKT 途径的磷酸化、PI3K/AKT 等信号通路相关。在LIU等[20]及笔者前期研究中[11]均发现LASP1 可激活PI3K/AKT 信号通路，而PI3K/AKT 信号通路，已被研究证实参与了GBM的细胞生长、血管形成、DNA修复[24]及耐药[25]；且目前在针对PI3K/AKT 信号通路的靶向抑制剂BKM120的研究中，也证实其可增强替莫唑胺的细胞毒性[26]。替莫唑胺主要通过诱导肿瘤DNA 烷基化损伤，从而诱导细胞凋亡；GBM 中这一作用可能被LASP1 异常激活PI3K/AKT信号通路所阻碍，从而增加了肿瘤细胞的抗药性。进一步研究LASP1 及其相关信号通路，或可为胶质母细胞瘤的治疗提供新的思路。

本研究仍具有局限性。首先，本研究为回顾性研究，纳入病例数相对较少且部分病例相对久远，有待于后期纳入更多研究对象及进行前瞻性研究；其次，关于LASP1与胶质母细胞瘤增殖及耐药的具体机制，尚需进一步分子实验室研究。

综上所述，LASP1在胶质母细胞瘤中高表达，与患者预后及替莫唑胺化疗敏感性相关，其可能是胶质母细胞瘤潜在的治疗靶点和预后评估标志物。