褪黑素MT2受体激动剂IIK-7对骨癌大鼠产生镇痛作用

张龙新　王菁　周敏

【摘要】 目的：研究褪黑素MT2受體激动剂IIK-7对骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）大鼠机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的影响。方法：将30只180～220 g清洁级雌性SD大鼠随机分为5组（n=6）：空白对照组（CONT组）、假手术组（Sham组）、骨癌痛组（BCP组）、IIK-7组及DMSO组。CONT组不做任何处理;Sham组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL PBS液，鞘内置管，术后第3天开始鞘内连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）;BCP组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）;IIK-7组大鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，术后第3天开始鞘内连续输注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;DMSO组大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，术后第3天开始鞘内连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）。用Von Frey纤毛测痛仪测定术前及术后第7、14、21天各组大鼠左后肢MWT;X线拍摄检测大鼠左后肢骨癌模型建立情况。结果：影像学结果显示，骨癌痛大鼠（BCP组）术侧胫骨骨皮质不连续，骨小梁缺失，周围组织明显肿胀。术前，各组大鼠术侧后肢MWT比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;术后第7、14、21天，CONT组与Sham组术侧后肢MWT较术前均无明显变化（P>0.05），但BCP组大鼠术侧后肢MWT均较CONT组明显降低（P<0.05）;术后第7天，IIK-7组大鼠术侧后肢MWT与BCP组比较，差异无统计学意义（P>0.05），术后第14、21天，IIK-7组大鼠术侧后肢MWT较BCP组均明显升高（P<0.05）。结论：褪黑素MT2受体激动剂IIK-7可以提高骨癌痛大鼠MWT，缓解骨癌大鼠的疼痛。

【关键词】 骨癌疼痛 褪黑素MT2受体 IIK-7 机械缩足反射阈值

Analgesic Effect of Melatonin MT2 Receptor Agonist IIK-7 on Bone Cancer Rats/ZHANG Longxin， WANG Jing， ZHOU Min. //Medical Innovation of China， 2020， 17（15）： 00-013

[Abstract] Objective： To study the effects of melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 on mechanical withdrawal threshold （MWT） of bone cancer pain （BCP） rats. Method： Thirty 180-220 g clean female SD rats were randomly divided into 5 groups （n=6）： blank control group （CONT group）， sham operation group （Sham group）， bone cancer pain group （BCP group）， IIK-7 group， DMSO group. No treatment was performed in the CONT group; 10 μL PBS solution was injected into the tibia bone marrow cavity of the left hind limb of the rats in the Sham group， and a sheath was placed in the tube， continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） was started on the third day after surgery; 10 μL of Walker256 rat breast cancer cell PBS suspension was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rats left hind limb， and DMSO （1 μL/h， 10 h） was continuously infused; in the IIK-7 group， 10 μL of Walker256 was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rat， PBS suspension of rat breast cancer cells， continuous intrathecal infusion of IIK-7 （1 μL/h， 0.5 μg/μL， 10 h） started on the 3rd day after operation; 10 μL Walker256 was injected into the tibia of the left hind limb of the DMSO group rats PBS suspension of rat breast cancer cells， and continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） began on the 3rd day after surgery. MWT of left hind limb was measured by von Freys ciliary pain detector before operation and on the 7th， 14th and 21th day after operation， and the establishment of bone cancer model of left hind limb was detected by X-ray. Result： The imaging results showed that in BCP group， the tibial cortex was discontinuous， the trabecula was absent and the surrounding tissue was swollen. Before operation， there were no significant differences in MWT between the each groups （P>0.05）; on the 7th， 14th and 21st day after operation， MWT of the hind limbs in the CONT group and the Sham group had no significant changes （P>0.05）， but MWT of the hind limbs in the BCP group was significantly lower than that in the CONT group （P<0.05）. On the 7th day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group was not significantly different from that in BCP group （P>0.05）. On the 14th and 21st day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group were significantly higher than those in BCP group （P<0.05）. Conclusion： Melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 can improve MWT and relieve pain of bone cancer rats.

[Key words] Bone cancer pain Melatonin MT2 receptor IIK-7 Mechanical withdrawal threshold

First-authors address： Fujian Provincial Maternity and Childrens Hospital， Fuzhou 350001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.15.003

骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）是原发性骨癌或乳腺癌、前列腺癌、肺癌等转移性骨癌患者最常见、最严重的并发症之一，可能导致患者出现睡眠障碍、焦虑、抑郁及自杀倾向，严重影响患者的生活质量[1]。虽然有多种治疗方法可以减轻骨癌疼痛，包括非甾体抗炎药、双膦酸盐、放疗和外科手术，但是阿片类药物的使用仍然是主要的镇痛措施。然而由于阿片类药物的成瘾性及耐受性限制了其在疼痛治疗中的使用[2]。此外，现代生活方式和慢性病显著增加了新病例的数量。因此探寻骨癌痛发病机制、优化骨癌痛治疗成为亟待解决的问题。

已有研究表明，在临床前模型中，MT及其受体激动剂对伤害性和神经病理性疼痛具有镇痛作用，而一些用于治疗睡眠障碍的MT激动剂具有良好的安全性和耐受性[3]。近年来，一些MT受体激动剂已被批准用于治疗睡眠和抑郁症，其他一些药物也进入了临床试验，包括TIK-301等[4]。但是MT受体激动剂尚未被批准用于疼痛的治疗。最近，Gobbi等[5]通过使用褪黑素MT2受体拮抗剂证明了MT的镇痛特性是由褪黑素MT2受体特异性介导的。且有研究顯示褪黑素MT2受体激动剂IIK-7对神经病理性疼痛有镇痛作用[6]，但其是否可以通过相似的机制治疗骨癌痛尚不清楚，有待进一步研究。为此笔者进行以下探究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）实验动物：选取清洁级健康清洁级雌性SD大鼠30只（180～220 g），吴氏实验动物有限公司采购，于20～25 ℃温度、（50±5）%空气湿度中饲养，可自由饮水摄食，并设置明暗生活环境各12 h。（2）主要仪器及试剂：超净台（美国Biological）、恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）、无菌离心管、无菌冻存管（福州市康诺生物技术有限公司）、离心机（德国Eppendorf公司）、显微镜（Olypus日本）、Von Frey纤毛测痛仪、鞘内药物输注泵（上海玉研科学仪器有限公司）、无菌手术器械、微量进样器（上海医疗器械厂）、一次性注射器、无菌纱布、棉球、4-0可吸收线、骨蜡、红霉素眼膏、青霉素钠注射液、水合氯醛、碘伏（福建省妇幼保健院）、Walker256大鼠乳腺癌细胞（上海久志生物科技有限公司）、PE管、胰酶、1640培养基、DMSO、IIK-7（福州市康诺生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 骨癌痛大鼠模型的建立及分组 大鼠称重后向其腹腔内注射0.6 mL/100 g 10%水合氯醛麻醉，后固定在T型台上;以大鼠角膜反射消失且其脚趾对镊子钳夹无反应评判达到满意的麻醉深度。使用75%酒精消毒左后肢皮肤;用手术刀在胫骨平台皮肤处切开约1 cm切口，用无齿镊分离肌肉，小纱球止血，清晰分离胫骨骨膜暴露骨面;用4.5号无菌注射针头在胫骨平台上垂直钻一小孔，拔出针头，将一5.5号无菌注射针头轻微弯曲，从小孔刺入胫骨骨髓腔，以测试骨髓腔的通畅情况;骨髓腔通畅后，用25 μL微量进样器抽取10 μL Walker256大鼠癌细胞PBS混悬液缓慢注入骨髓腔，当液体反流时，缓慢拔出微量进样器，立即用骨蜡封闭穿刺孔，穿刺孔周围的癌细胞用无菌纱布擦除;并用蘸取75%酒精纱布擦拭手术切口以杀死遗留在骨髓腔外的癌细胞，之后逐层消毒缝合手术切口;接着稀释8万单位青霉素注射入大鼠腹腔内，切口处涂适量红霉素软膏以预防手术部位感染;最后将大鼠放在37 ℃热板上复苏后放入笼中继续按原来的条件饲养。将30只大鼠随机分为5组，每组6只：（1）空白对照组（CONT组）不做任何处理;（2）假手术组（Sham组）大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL PBS液，鞘内置管，术后第3天开始鞘内连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）;（3）骨癌痛组（BCP组）大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）;（4）IIK-7组大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，术后第3天开始鞘内连续输注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;（5）DMSO组大鼠左侧后肢胫骨骨髓腔内注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌细胞PBS混悬液，术后第3天开始鞘内连续输注DMSO（1 μL/h，10 h）。

1.2.2 鞘内置管 10%水合氯醛麻醉大鼠，依据大鼠身体长度，剪一段PE-10导管（20～23 cm），并用微量进样器将导管内注满生理盐水，将PE管送入插管的12号针头内，在针头后3 cm处做标记，再将PE管全部送入针头;将麻醉的大鼠用剃毛机剔除大鼠颈部及腰骶部毛发，切开皮肤暴露手术视野并用碘伏无菌消毒;摸到骼脊部位，在两骼脊连线中点处切开筋膜、肌肉，将导针紧贴脊柱旁开45°～60°角，倾斜向上30°角方向旋转进针，有落空感时停止进针，可见大鼠尾部轻微摆动;用镊子将PE管向脊髓上方缓慢推送至标记的3 cm处，小心旋转拔出导针，留置PE管，打结并固定于进针肌肉处;将灌胃针从颈部经皮下送至插管处，将PE管经灌胃针送至颈部，在颈部打结并固定;将颈部及腰骶部皮肤缝合。若PE管内有血液，注射10 μL人工脑脊液并用打火机封口;无血液则可直接封口。术后将动物放回清洁笼内，大鼠单笼饲养，连续3 d，每天腹腔注射青霉素防止感染。

1.2.3 机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的测定 准备好Von Frey测痛纤毛，分别为0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g，将待检测大鼠放进检测箱中（26 cm×14 cm×26 cm）适应30 min，待小鼠安静后，依次用标准化的Von Frey测痛纤毛（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g）垂直刺激大鼠左后肢足底中部，直至纤毛呈90°弯曲，观察大鼠缩足反应。每只大鼠接受5次同一克数纤毛刺激，每次刺激间隔2 min。若大鼠出现3次或3次以上缩足反应，则记该纤毛克数作为该大鼠的机械痛阈。

1.2.4 影像学检查 麻醉方法同建立骨癌痛模型时的麻醉方法，将大鼠固定在T型台上，用X射线（50KVP）拍摄大鼠左后肢，观察其胫骨中癌细胞的生长情况及胫骨被破坏的情况，拍摄完毕将大鼠放在37 ℃热板上复温，苏醒后将其送回笼中继续饲养。

1.3 观察指标 观察术前及术后第7、14、21天大鼠左后肢MWT;拍摄X线片，观察术后第21天大鼠左后肢骨被侵袭情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线检查结果 正常大鼠（CONT组）骨小梁完整，骨皮质连续;骨癌痛大鼠（BCP组）术侧胫骨骨皮质不连续，骨小梁缺失，周围组织明显肿胀。见图1。

2.2 骨癌對大鼠MWT的影响 术前测定各组大鼠术侧后肢MWT基础值均相近，比较差异均无统计学意义（P>0.05）;术后第7、14、21天，CONT组与Sham组术侧后肢MWT较术前均无明显变化（P>0.05），但BCP组大鼠术侧后肢MWT均较CONT组明显降低（P<0.05）。见图2和表1。

2.3 IIK-7对骨癌痛大鼠MWT的影响 术前测定各组大鼠术侧后肢MWT基础值均相近，比较差异均无统计学意义（P>0.05）;术后第7天，IIK-7组大鼠术侧后肢MWT与BCP组比较差异无统计学意义（P>0.05），术后第14、21天，IIK-7组大鼠术侧后肢MWT较BCP组均明显升高（P<0.05）。见图3、表2。

3 讨论

目前，癌症发病率越来越高，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌等很容易发生骨转移，引起剧烈的骨癌痛。目前阿片类药物是临床上治疗骨癌痛的常用药物，但是由于成瘾性、耐受性及严重不良反应等限制了其在骨癌痛中的应用。

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺），在调节睡眠觉醒周期、抑制肿瘤进展、改善免疫系统功能、控制机体各组织的稳态等生理过程中发挥重要作用[7]。然而，研究发现，褪黑素及其受体激动剂在控制慢性疼痛方面有很强的潜力[8]。IIK-7是MT的一个四环类似物，专门与MT受体结合，这种激动剂对MT2受体亚型的选择性是MT1的90倍，对MT2受体亚型的亲和力是MT的6倍[6]。IIK-7和MT一样可以是促进睡眠和保护细胞免受电磁压力[9]。

有研究显示IIK-7可以提高神经病理性疼痛大鼠的MWT，但是其对骨癌痛的影响尚不清楚[4]。本实验中通过大鼠胫骨骨髓腔内注射Walker256大鼠乳腺癌细胞建立大鼠胫骨癌痛模型，鞘内输注IIK-7，观察其对骨癌痛大鼠机械痛阈的影响。实验观察到骨癌痛组大鼠术侧胫骨骨皮质不连续，骨小梁疏松，且建模后第7天开始，术侧后肢MWT显著降低，说明骨癌痛模型建立成功。建模后第14、21天，IIK-7组大鼠MWT均较BCP组明显升高（P<0.05），说明IIK-7对骨癌痛有一定的缓解作用。

此外，褪黑激素具有抗氧化和抑癌作用[10]。一些证据显示褪黑激素对多种类型的肿瘤有抑制作用，包括乳腺、子宫内膜、前列腺、卵巢、肠道和肝脏肿瘤等[11]。有研究显示骨代谢与褪黑激素水平相关，褪黑激素对骨连接细胞增殖有影响[12-13]。

有研究表明，在特定时间点，褪黑激素水平较低，且与骨肉瘤的高发有关，猜测褪黑激素可能会对骨肉瘤细胞有抑制作用[11]。多项研究显示褪黑激素对MG-63骨肉瘤细胞的抗增殖作用，并报道褪黑激素的抑制活性与丝裂原激活激酶和AKT信号通路有关。褪黑激素通过调节多种信号通路干扰骨肉瘤细胞的增殖[8]。褪黑激素特异性抑制ERK1/2的磷酸化激活，还表明褪黑激素的抑制功能与细胞周期蛋白CDK4和D1以及细胞周期蛋白CDK1和B1的下调有关[14]。因此褪黑素受体激动剂在缓解骨癌痛的同时是否有抑制骨癌发展的作用值得进一步研究。

有研究显示IIK-7是通过活性氧而抑制神经病理性疼痛[16]。活性氧（ROS）是正常代谢过程中产生的天然副产物，在细胞信号转导和体内平衡中起重要作用[15]。ROS种类很多，包括羟基自由基、超氧自由基、一氧化氮、过氧化氢和过氧亚硝酸盐[16]。正常情况下，ROS产生受到抗氧化防御系统的严格调控[17]。ROS参与炎症性疼痛和神经性疼痛的发病机制已被多次报道[18]，此外，ROS清除剂、超氧化物歧化酶（SOD）模拟化合物和抗氧化剂已被证明在啮齿动物疼痛模型中具有显著的镇痛作用[19]。有研究显示ROS清除剂能改善骨癌痛大鼠的机械痛[20]，但是IIK-7是否是通过ROS影响骨癌痛大鼠尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，褪黑素MT2受体激动剂IIK-7可以提高骨癌大鼠机械缩足反射阈值，对骨癌痛大鼠产生镇痛作用，但是其潜在的机制以及其是否能抑制骨癌发展尚不清楚，值得进一步研究。

参考文献

[14] Liu L，Xu Y，Reiter R J，et al.Inhibition of ERK1/2 Signaling Pathway is Involved in Melatonins Antiproliferative Effect on Human MG-63 Osteosarcoma Cells[J].Cell Physiol Biochem，2016，39（6）：2297-2307.

[15] Moris D，Spartalis M，Tzatzaki E，et al.The role of reactive oxygen species in myocardial redox signaling and regulation[J].Ann Transl Med，2017，5（16）：324.

[16] Xu J，Wei X，Gao F，et al.NADPH oxidase 2 derived ROS contributes to LTP of C-fiber evoked field potentials in spinal dorsal horn and persistent mirror-image pain following high frequency stimulus of the sciatic nerve[J].Pain，2019.

[17] Zhou T，Chuang C C，Zuo L.Molecular Characterization of Reactive Oxygen Species in Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury[J].Biomed Res Int，2015，2015：864946.

[18] Li Y，Li H，Han J，Sphingosine-1-phosphate receptor 2 modulates pain sensitivity by suppressing the ROS-RUNX3 pathway in a rat model of neuropathy[J].J Cell Physiol，2020，235（4）：3864-3873.

[19] Yu X，Chen C，Ke Q，et al.EGb761 Ameliorates Neuropathic Pain by Scavenging Reactive Oxygen Species[J].Pharmacology，2015，95（5-6）：293-299.

[20] Zhou Y Q，Liu D Q，Chen S P，et al.Reactive oxygen species scavengers ameliorate mechanical allodynia in a rat model of cancer-induced bone pain[J].Redox Biol，2018，14：391-397.

（收稿日期：2020-03-12） （本文編辑：董悦）