T-SPOT.TB、ADA、TBDNA对结核性胸膜炎的诊断价值分析

陈炎城 何丹 曾运泉

【摘要】 目的：探討T-SPOT.TB、ADA、TBDNA对结核性胸膜炎的诊断价值。方法：选取本院2016年8月-2019年3月收治的30例结核性胸膜炎患者纳入结核性胸膜炎组，25例癌性胸腔积液、2例肺炎性胸腔积液、2例脓胸纳入非结核性胸膜炎组（共29例）;使用ELISPOT试剂盒对胸腔积液进行T-SPOT.TB分析、日立HITACHI7600-110型全自动生化分析仪对胸腔积液进行ADA活性检测、PCR反应检测胸腔积液TBDNA水平。结果：T-SPOT.TB敏感度为80.0%（24/30），特异度为75.9%（22/29），结核性胸膜炎组抗原A孔平均计数（41.54±13.52）个，高于非结核性胸膜炎A孔平均计数（9.21±3.79）个，差异有统计学意义（P<0.05）。ADA敏感度为86.7%（26/30），特异度为79.3%（23/29），ADA均值（54.05±23.04）U/L，高于非结核性胸膜炎均值（13.55±7.66）U/L，差异有统计学意义（P<0.05）。TBDNA阳性比例33.3%（10/30）明显高于非结核性胸膜炎阳性比例10.3%（3/29）（P<0.05），TBDNA诊断的敏感度为33.3%（10/30），特异度为86.7%（26/29）。外周血T-SPOT.TB敏感度、胸腔积液ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs 33.3%）（P<0.05），T-SPOT.TB敏感度与ADA敏感相近（80.8% vs 86.7%）（P>0.05）。TBDNA特异度均高于T-SPOT.TB特异度、ADA特异度（89.7% vs 75.9%、79.3%）（P<0.05）;T-SPOT.TB特异度、ADA特异度相近（75.9% vs 79.3%）（P>0.05）。当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测均为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测为阳性，其特异度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差异无统计学意义（P>0.05）。当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测中任意一项为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测任意一项为阳性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：T-SPOT.TB、ADA与TBDNA联合检测是敏感度、特异度较高的结核性胸膜炎的诊断方法，其串联使用时，特异度最高，其并联使用时，敏感度度最高。

【关键词】 T细胞斑点试验 腺苷脱氨酶 TBDNA 结核性胸膜炎 诊断价值

The Value of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA in the Diagnosis of Tuberculous Pleurisy/CHEN Yancheng， HE Dan， ZENG Yunquan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 0-036

[Abstract] Objective： To investigate the value of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Method： From August 2016 to March 2019， 30 patients with tuberculous pleurisy were selected as tuberculous pleurisy group， 25 patients with Cancerous Pleural effusion， 2 patients with pneumonia pleural effusion and 2 patients with leakage fluid were selected as non tuberculous pleurisy group with a total of

29 cases. T-SPOT.TB analysis was performed for pleural effusion with ELISPOT kit， ADA activity test was performed for pleural effusion with Hitachi Hitachi 7600-110 automatic biochemical analyzer， and the level of TBDNA in pleural effusion was detected by PCR. Result： The sensitivity of T-SPOT.TB was 80.0% （24/30）， and the specificity was 75.9% （22/29）. The average number of a-hole in tuberculous pleurisy group was （41.54±13.52）， which was higher than that in non tuberculous pleurisy group （9.21±3.79）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of ADA was 86.7% （26/30）， the specificity was 79.3% （23/29）， and the mean value of ADA was （54.05±23.04） U/L， which was higher than that of non tuberculous pleurisy （13.55±7.66） U/L，

and the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive rate of TBDNA was 33.3% （10/30）， which was significantly higher than that of non tuberculous pleurisy 10.3% （3/29） （P<0.05）. The sensitivity and specificity of TBDNA diagnosis were 33.3% （10/30） and 86.7% （26/49）. The sensitivity of T-SPOT.TB in peripheral blood and ADA in pleural effusion were higher than that of TBDNA （80.0%， 86.7% vs 33.3%） （P<0.05）. The sensitivity of T-SPOT.TB was similar to that of ADA （80.8% vs 86.7%） ， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The specificity of TBDNA were higher than those of T-SPOT.TB and ADA （89.7% vs 75.9%， 79.3%）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The specificity T-SPOT.TB and ADA were similar （75.9% vs 79.3%）， and the differences were not statistically significant （P>0.05）. When T-SPOT.TB， ADA and TBDNA were all positive， compared with T-SPOT.TB and ADA， T-SPOT.TB and TBDNA， ADA and TBDNA， the specificity was the highest （96.6% vs 89.7%， 93.1%， 93.1%）， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. When one of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA was positive， compared with T-SPOT.TB and ADA， T-SPOT.TB and TBDNA， ADA and TBDNA， the sensitivity was the highest （96.7% vs 93.3%， 76.7%， 80.0%）， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： The combination of T-SPOT.TB， ADA and TBDNA is the diagnostic methods of tuberculous pleurisy with high sensitivity and specificity. When they are used in series， the specificity is the highest. When they are used in parallel， the sensitivity is the highest.

[Key words] T cell spot test Adenosine deaminase TBDNA Tuberculous pleurisy Diagnostic value

First-authors address： Meizhou Peoples Hospital， Meizhou 514000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.008

结核性胸膜炎是一种由结核分枝杆菌引起的呼吸系统疾病，以发热、胸痛和咳嗽为主要临床表现[1-2]。结核性胸膜炎的诊断仍然受到检测方法和技术的限制。胸片和超声技术在结核性胸膜炎诊断中的应用由于特异性差而受到限制，这反过来增加了对该病的诊断和治疗难度。结核性胸膜炎的明确诊断取决于胸膜积液或胸膜组织中结核分枝杆菌的分离，但分枝杆菌培养很费时，需要数周才能获得结果[3]。此外，即使采用先进的培养技术，积液的诊断率仍可达到63%。尽管也可以通过胸膜组织学方法进行诊断，但对于老年人，潜在合并症和高危人群，其可能不耐受。细胞免疫功能在免疫疾病的发展中起重要作用。相关研究表明，结核分枝杆菌的控制与巨噬细胞密切相关[4]。据报道，T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）在檢测肺外结核方面具有较高的敏感性[5-6]，多种胸膜生物标志物已用于辅助结核性胸膜炎的诊断，这些包括腺苷脱氨酶（ADA），干扰素-γ（IFN-γ）和胸腔积液TB-DNA的测定。ADA可以参与多种炎症反应，可以诱导组织损伤和炎症反应[7]。荟萃分析显示，ADA和TB-DNA对于结核性胸膜炎似乎相对准确尽管荟萃分析显示，TB-DNA虽然是结核分枝杆菌感染的有力指标，但在胸腔积液中TB-DNA并不优于ADA和IFN-γ水平[8]。本研究拟探讨T-SPOT.TB、ADA、TBDNA对结核性胸膜炎的诊断价值，为结核性胸膜炎的早期诊断及治疗提高理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院2016年8月-2019年3月收治的结核性胸膜炎患者30例以及非结核性胸膜炎29例（25例癌性胸腔积液、2例肺炎性胸腔积液、2例脓胸）为研究对象。（1）纳入标准：①结核性胸膜炎患者经临床症状、胸膜活检、X线检查确诊;②涂片或培养有结核分枝杆菌;③组织或胸膜活检病理为结核病变;④经抗结核治疗胸腔积液明显吸收。（2）排除标准：①妊娠期孕妇;②严重呼吸道疾病者;③近3个月有手术、创伤史。收集两组患者临床特征和实验室检查结果（胸膜液中的蛋白质和乳酸脱氢酶、痰和胸膜液的耐酸涂片和分枝杆菌培养）。所有患者接受了胸腔穿刺术，并收集50 mL胸膜液。常规诊断测试包括细胞计数，耐酸涂片以及细菌，真菌和分枝杆菌的培养。胸部影像学包括放射线照片和计算机断层扫描（CT）扫描。记录胸腔积液的位置和数量（如果胸腔不透性小于胸部X线检查的一半胸腔积液，则胸腔积液的数量为小;反之为大）。该研究经本院医学伦理协会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 检测方法 （1）T-SPOT.TB的检测：使用ELISPOT试剂盒（T-SPOT-TB;Oxford Immunotec Ltd，英国牛津）进行T-SPOT.TB分析。简而言之，使用Ficolle Hypaque分离胸腔积液单核细胞（PEMC），然后洗涤，重新悬浮并计数。将PEMC添加到用小鼠包被的孔中（每孔250 000个PEMC）。单克隆抗IFN-γ抗体包含6-kDa早期分泌的抗原靶标（ESAT-6）或培养滤液蛋白10（CFP10）和促分裂原（植物血凝素）（阳性对照），进行板的培养，洗涤，复染和可视化。

（2）ADA的检测：ADA检测采用速率法，仪器采用日立HITACHI7600-110型全自动生化分析仪。ADA活性使用市售试剂盒（腺苷脱氨酶测定试剂盒，Diazyme Laboratories，Poway，CA，美国）在37 ℃下进行比色测定的。抽取胸腔积液3 mL，离心取上清液，通过添加ADA特异性抑制剂来确定ADA同工酶的活性。ADA的单位定义为在37 ℃下每分钟从腺苷产生1 μmol肌苷的酶量，结果以每升胸膜液国际单位（IU/L）表示。（3）TBDNA的测定：患者胸腔积液10 mL加入180 mL消化液（通过将10 mL Tween 20加到2 mL TE Buffer，pH 8.0中制备）并涡旋混合。以10 000 rpm离心1 min后，将20 mL蛋白酶K（20 mg/mL）添加至下部澄清相中并轻轻混合。将样品在56℃孵育1 h，然后在90 ℃孵育 以灭活蛋白酶K。短暂离心后，将较低的澄清相转移到easyMAG容器中。使用Generic 2.0.1程序提取DNA。使用TBDNA引物和TaqMan探针。每个

30 mL反应液均包含15 μL Quantitech PCR Mastermix（QIAGEN），每种引物0.3 μM，0.2 μM FAM（荧光素）标记的MTBC探针，0.05 μM Cy5标记的PhHV探针和10 μL DNA。使用ABI Prism 7500序列检测系统（Applied Biosystems，Warrington，UK）使用擴增曲线进行PCR扩增：在50 ℃进行2 min的循环，在95 ℃进行10 min的循环，然后进行15次的50个循环在90 ℃的温度下进行1 s，在60 ℃的温度下进行1 min，6CT截止值。当CT值为40表示实时PCR阳性结果。

1.3 诊断标准 （1）T-SPOT.TB的诊断标准：对斑点进行计数，如果测试孔中的斑点数减去对照孔中的斑点数≥6，或两个测试孔中的斑点计数至少是阴性对照孔的两倍，为阳性，反之则为阴性;

（2）ADA的诊断标准：根据试剂盒设定的指标临界值，ADA<24 U/L为阴性，反之则为阴性;（3）TBDNA的诊断标准：当TBDNAC的T值≥40表示实时PCR阳性结果，反之则为阴性。

1.4 统计学处理 使用SPSS 23.0统计软禁进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的单项诊断价

值 T-SPOT.TB敏感度为80.0%（24/30），特异度为75.9%（22/29），结核性胸膜炎组抗原A孔平均计数（41.54±13.52）个，高于非结核性胸膜炎A孔平均计数（9.21±3.79）个，差异有统计学意义（P<0.05）。ADA敏感度为86.7%（26/30），特异度为79.3%（23/29），ADA均值（54.05±23.04）U/L，

高于非结核性胸膜炎均值（13.55±7.66）U/L，差异有统计学意义（P<0.05）。TBDNA阳性比例33.3%（10/30）明显高于非结核性胸膜炎阳性比例10.3%（3/29）（P<0.05），TBDNA诊断的敏感度为33.3%（10/30），特异度为86.7%（26/29）。外周血T-SPOT.TB敏感度、胸腔积液ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs 33.3%）（P<0.05），T-SPOT.TB敏感度与ADA敏感相近（80.8% vs 86.7%）（P>0.05）。TBDNA特异度均高于T-SPOT.TB特异度、ADA特异度（89.7% vs 75.9%、79.3%）（P<0.05）;T-SPOT.TB特异度、ADA特异度相近（75.9% vs 79.3%）（P>0.05）。见表1。

2.2 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的串联试验的诊断价值分析 当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测均为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测为阳性，其特异度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 T-SPOT.TB、ADA、TBDNA的并联试验的诊断价值分析 当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测中任意一项为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测任意一项为阳性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

结核性胸膜炎是继淋巴结结核之后活动性结核杆菌感染的第二常见的肺外表现，占结核病例的23%，在西欧占胸腔积液的30%。从疾病发作开始，可能在7～30 d产生胸腔积液。作为一种常见的单侧胸腔积液疾病，结核性胸膜炎可影响任何年龄的患者。胸腔积液的形成是结核性胸膜炎的主要特征。研究表明，世界范围内结核性胸膜炎的发病率相对较高，主要类型是结核性胸膜炎。临床症状的观察和生化检查对胸腔积液的检测对于结核性胸膜炎的诊断都是重要的。值得注意的是，缺乏典型的表现以及生化指标和常规检查的低特异性增加了诊断的难度。因此，需要开发可靠的结核性胸膜炎诊断方法。

作为结核病诊断的主要方法，T-SPOT.TB可用于准确确定可分泌抗体和细胞因子的细胞数量，因此T-SPOT.TB的结果可反映体内的细胞因子水平[9-10]。研究表明，使用T-SPOT.TB技术可以提高结核性胸膜炎诊断的阳性率，但是有误诊的报道。因此，需要联合诊断以提高结核性胸膜炎的阳性诊断率[11]。T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断性能已在各种环境下进行了检查，大多数研究从敏感性和特异性分析中排除了中间结果。 尽管研究之间存在异质性，但有两个重要发现。 首先，在低负荷情况下，具有高度免疫能力的患者组的研究显示，由于强烈的胸膜T细胞反应，假阴性结果较少。其次，胸膜液T-SPOT.TB检测灵敏度更高，不确定的结果较少，比QuantiFERON-TB金管内（QFT-GIT）分析法要高，这反映了T-SPOT.TB分析法对单核细胞数量的强制性要求[12-13]。ADA是T辅助淋巴细胞亚群的特征性细胞因子。结核分枝杆菌感染后，病变部位的巨噬细胞将被激活，胸腔积液和血液中的ADA含量将逐渐增加。研究表明，ADA对结核病中Th1型免疫反应具有双重调节作用。一方面，ADA可以诱导CD4+向Th1分化。另一方面，ADA可以抑制Th1细胞增殖，从而抑制由Th1型免疫反应引起的对身体的损害[14-15]。TBDNA编码的TBDNA蛋白具有228个氨基酸，相对分子质量约为24 000，是一种仅由MTB复合体（包括MTB，牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌）分泌的特定蛋白。蛋白在复制的早期由结合杆菌复合物分泌。TBDNA约占上清液培养滤液中总蛋白的8%。作为候选诊断标志物，TBDNA一个突出优点是它仅在极少数结核菌株中表达（例如东京，莫劳和俄罗斯等），而在绝大多数结核菌株中却不表达[16]。在活动性结核病检测中，用作皮肤测试抗原的TBDNA的敏感性和特异性分别高达98.1和100%。使用生物信息学，发现没有表位与TBDNA蛋白相似，这表明TBDNA是独特的[17-18]。

本次研究结果显示，T-SPOT.TB敏感度、ADA敏感度均高于TBDNA（80.0%、86.7% vs33.3%），T-SPOT.TB敏感度與ADA敏感相近（80.0% vs 86.7%）。TBDNA特异度均高于外周血T-SPOT.TB特异度、胸腔积液ADA特异度（89.7% vs 75.9%、79.3%）;T-SPOT.TB特异度、ADA特异度（75.9% vs 79.3%）相近。当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测均为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测为阳性，其特异度最高（96.6% vs 89.7%、93.1%、93.1%），但差异无统计学意义。说明T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3串联诊断能够更好地降低误诊率。当T-SPOT.TB、ADA、TBDNA3项检测中任意一项为阳性，相比于T-SPOT.TB和ADA、T-SPOT.TB和TBDNA、ADA和TBDNA2项检测任意一项为阳性，其敏感度最高（96.7% vs 93.3%、76.7%、80.0%），但差异无统计学意义（P>0.05）。说明T-SPOT.TB、ADA、TBDNA并联诊断能够更好地降低漏诊率。

综上所述，T-SPOT.TB、ADA、TBDNA是敏感度、特异度较高的结核性胸膜炎的诊断方法，其串联使用时，特异度最高，其并联使用时，敏感度度最高。

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（收稿日期：2020-03-20） （本文编辑：周亚杰）