PCR技术从需要多种酶到一种酶的推测

张卓鹏

摘要：试图从不断减少酶的种类，有利于反应条件的控制角度来推测科学家们当初的PCR设计思路。

关键词：PCR技术;DNA复制;酶

中图分类号：Q-49 文献标志码：E

聚合酶链式反应（polvmerase chain reaction，PCR）是20世纪80年代发展起来的新技术，它能以极少量的DNA为模板，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，现已广泛应用于分子生物学、基因工程及其他与DNA鉴定相关的领域。PCR虽然为一个简单的实验，但在实际过程中可能会出现各种问题。产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作、试剂质量、PCR反应过程中各种试剂的含量，以及反应条件、温度设置等。下面试图从不断减少酶的种类，有利于反应条件的控制角度来推测科学家们当初的PCR设计思路。

1PCR技术与细胞内DNA复制的比较

PCR的循环过程分为三部分：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。PCR过程和细胞内DNA复制的比较见表1。

2PCR技术从需要多种酶到一种酶的推测

PCR技术是由穆里斯等人于1988年发明的，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。核酸体外扩增的最早设想是由美国的教授科兰纳（曾获得1968年诺贝尔医学奖）1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。当时，科兰纳实验室己具备了进行PCR的条件，遗憾的是没有付诸实践，后来正是穆里斯等人把PCR技术引向了实际应用。然而，1983年8月，穆里斯首次进行有关PCR原理的报告，其他人却反应冷淡甚至持怀疑态度，认为这个原理太简单了，如果可行，早就有人做了。

从表1胞内DNA复制和PCR过程的异同比较可看出，细胞内DNA复制是一个复杂的化学过程，需经过多步连续反应，且需要一系列的酶参与反应。理论上讲，体外要模拟成功，就应与体内条件模拟的越接近、越相似，成功的可能性才会越大。实际上，要在体外条件下进行，应使反应过程简单化，包括酶种类的减少，中间反应步骤的减少，这样所获得产物的纯度将会提高，便于鉴定;酶种类的减少，也使反应的具体条件如温度、pH等便于控制。那么，在PCR设计中，如何减少酶的种类呢？

（1）解旋酶、DNA连接酶、ATP的去除。

在高温（90～95℃）下，DNA分子会自动解旋，且两条单链将完全解开。因此，体外DNA复制时，不需要解旋酶，也不需要消耗ATP;体外又因DNA两条单链完全解开，故将来合成子链时，两条子链都是连续合成的，于是就不会出现冈崎片段。这样就不再需要DNA连接酶来连接一个个冈崎片段。

（2）引物由RNA片段改换成DNA单链片段，RNA酶的去除。

利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段己知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。知道引物的核苷酸序列，通过DNA合成儀用化学方法便可直接人工合成。故PCR技术中引物由原先细胞内的RNA片段改换成DNA单链片段。这样就不再需要RNA酶水解RNA引物，PCR反应体系中酶的种类再次减少。

（3）耐高温DNA聚合酶的成功分离。

由于DNA子链合成延伸时，需DNA聚合酶将单个的核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键，故PCR设计中DNA聚合酶不可或缺。然而，从体内提取的DNA聚合酶一般在高温条件下都会变性失活，寻找耐高温的DNA聚合酶势必成为PCR技术突破的瓶颈。我国台湾科学家钱嘉韵第一个报道分离耐高温DNA聚合酶的工作。她从美国黄石国家公园里热泉中的嗜热菌中成功分离出了耐高温的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶，从而使PCR变成真正的成熟技术。穆里斯等人正是按照钱嘉韵发明的操作步骤，成功分离出Taq/DNA聚合酶。

科学上许多伟大的发现，往往离不开众多科学家不懈的努力，尤其离不开科学家大胆的猜想和实践创新，PCR技术从需要多种酶到一种酶的推测便是一个经典范例，让人深受启发。