ASPM基因在乳腺癌中的表达及临床意义

吕珊妹 徐文杰 王艺臻 董学君

乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因[1, 2]。尽管手术结合放化疗的诊疗手段取得了一定的提高，但其预后不良的情况并未改善[3,4]。因此，从分子水平深入研究乳腺癌潜在的发生、发展机制，对延长乳腺癌患者的生存时间具有重要意义。细胞有丝分裂相关基因ASPM (abnormal spindle microtubule assembly)位于1号染色体，编码3477个氨基酸残基组成的蛋白质，在正常细胞有丝分裂过程中发挥纺锤体功能是必不可少的[5, 6]。近年来研究发现，ASPM在多种癌症中异常表达，且与肝癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等多种肿瘤的不良预后显著相关[6～9]。然而，ASPM参与癌症进展的机制尚不明确，并且其在乳腺癌中的表达和作用机制的研究较少。为深入研究ASPM与乳腺癌的相关性，本研究使用Oncomine在线数据库分析ASPM在乳腺癌中的表达水平，并利用GEO (gene expression omnibus)和TCGA (the cancer genome atlas)公共数据库中的乳腺癌基因芯片数据，探讨ASPM与乳腺癌患者临床病理指标的相关性及其对预后的影响。通过基因富集分析 (gene sets enrichment analysis, GSEA)、String以及TIMER数据库进一步预测ASPM在乳腺癌发生、发展中可能参与的信号通路及作用机制。同时RT-qPCR验证ASPM在乳腺癌临床组织样本中的表达情况。

材料与方法

1.ASPM表达量分析:利用Oncomine数据库 (https://www.oncomine.org/resource/login.html) 分析ASPM在乳腺癌组织中的表达情况。以正常组织为对照，选择差异表达倍数大于2倍、基因排位于前10%且P=0.000的结果，选择箱式图展现结果。本研究设置的筛选条件：①Gene：ASPM；②Analysis Type：cancer vs normal analysis；③Cancer Type：breast cancer；④Data Type：mRNA；⑤Sample Type：Clinical Specimen。

2.ASPM与乳腺癌患者临床资料相关性分析:在美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)上的GEO公共数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载乳腺癌基因表达谱数据集GSE3494的系列矩阵数据文件，以获得表达原始数据和临床资料。GSE3494采用的平台是Affymetrix公司的GPL96基因表达芯片 (Affymetrix Human Genome U133A Array)，包含251例乳腺癌样本及对应的临床信息。从TCGA公共数据库 (https://cancergenome.nih.gov/)中共下载1090例乳腺癌组织样本，排除目的基因表达值和临床信息缺失的病例。根据ASPM表达值的中位数分为高表达组和低表达组，χ2检验分析ASPM表达与临床病理指标的相关性。GSE3494数据库中采用Kaplan-Meier法分析ASPM表达与乳腺癌患者预后的关系。采用Kaplan-MeierPlotter在线数据库选取乳腺癌页面，分析ASPM表达与乳腺癌患者总生存期的关系。

3.基因富集分析:官方网站(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) 下载GSEA 2.2.4版本并按照其运行说明进行GSEA分析。将GSE3494数据集中的乳腺癌样本根据ASPM (219918_s_at)表达值的中位数分为ASPM高表达组和ASPM低表达组。选择MsigDB数据库的KEGG基因集 (c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt)作为参照基因集，按缺省加权富集统计的方法，设置随机组合次数为1000次，错误发现率 (FDR)<0.25以及P<0.05，预测高表达ASPM富集的基因集，探究ASPM可能参与的信号通路机制研究。

4.蛋白质相互作用网络分析:STRING数据库 (https://string-db.org/)是一个包含2031种物种和960万种蛋白质的在线数据库，利用该数据库可分析蛋白质之间的相互作用，结合基因富集分析结果，进一步分析乳腺癌中ASPM相关蛋白的相互作用。

5.TIMER数据库分析:利用TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，对ASPM在乳腺癌组织中的表达与BUB1、CCNA2、CDC20C、CDK1、DLGAP5C、KIF11C、KIF23、NCAPG、TTK的表达进行Spearman相关性分析。本研究设置的筛选条件：①Cancer Type：breast invasive carcinoma，共1093例；②gene symbols (Y-axis)：ASPM；③gene symbols (X-axis)：BUB1、CCNA2、CDC20C、CDK1、DLGAP5C、KIF11C、KIF23、NCAPG、TTK；④correlation adjusted by：tumor purity。

6.RT-qPCR:采用Trizol 法提取乳腺癌组织样本总RNA，使用TaKaRa One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ进行PCR扩增，反应条件为: 42℃ 5min, 95℃ 10s (反转录)；95℃ 5s，60℃ 20s，40个循环(PCR反应)；95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s (溶解曲线分析)。以β-actin为内参，用2-△△Cq法计算ASPM mRNA的相对表达量。PCR引物序列如下：ASPM上游引物：5′-TCCGAAGTTGTAATCGCAGT-3′，下游引物： 5′-GTTGCAGGGGATTTGTGATT-3′； β-actin上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCAC-GAT-3′。

结 果

1.乳腺癌组织中ASPM的表达情况:Oncomine数据库显示，与正常乳腺组织比较，ASPM基因在乳腺癌组织中高表达，共有9个数据库，2880个样本。在TCGA Breast芯片包含的6个子数据库中，ASPM在乳腺癌组织中的表达分别是正常乳腺组织的9.248、7.378、9.379、8.673、6.466、7.590倍 (P<0.01，图1)。

图1 Oncomine子数据库中ASPM mRNA在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达

2.乳腺癌组织中ASPM表达与临床病理指标的相关性：本研究利用TCGA数据库中1090例乳腺癌患者 (表1)和GSE3494数据集中251例乳腺癌患者 (表2)的ASPM mRNA相对表达量及临床随访资料，研究ASPM表达与乳腺癌临床病理指标的相关性。在两个数据库中，ASPM表达均与ER、PR水平 (P=0.000)显著相关，在TCGA数据库中ASPM表达还跟年龄 (P=0.002)以及TNM分期中的T分期 (P=0.000)和N分期 (P=0.030)显著相关。GSE3494数据集分析结果显示，ASPM还与肿瘤直径(P=0.000)和淋巴结浸润 (P=0.012)显著相关。

3.ASPM表达与乳腺癌患者预后的关系：本研究利用GSE3494数据集 (251例乳腺癌患者)和Kaplan-MeierPlotter在线数据库分析乳腺癌组织ASPM表达与预后的关系。GSE3494数据集生存分析结果为Log-Rank=9.821，P=0.002 (图2A)；Kaplan-MeierPlotter在线数据库结果为HR=1.71， 95%CI： 1.38～2.13，P=0.000(图2B)，ASPM高表达乳腺癌患者总体生存率短于低表达患者，差异有统计学意义。

表1 ASPM与乳腺癌患者 (GSE3494)的临床病理指标的相关性

表2 ASPM与乳腺癌患者 (TCGA)的临床病理指标的相关性

4.ASPM高表达的基因集富集分析:本研究在明确ASPM基因与乳腺癌多个临床病理指标及预后的相关性后，进一步分析ASPM基因促进乳腺癌发生、发展的作用机制。将GSE3494数据集中的251个乳腺癌样本按照ASPM (219918_s_at)表达值的中位数分为ASPM高表达组 (n=126)和ASPM低表达组 (n=125)，选用 MsigDB 数据库中的KEGG基因集作为参照基因集进行GSEA分析。ASPM高表达组乳腺癌样本主要富集在细胞周期 (图3A)、氧化磷酸化 (图3B)、DNA修复 (图3C)、错配修复 (图3D)、剪接体 (图3E)和蛋白酶体 (图3F)基因集。

5.与ASPM相关蛋白的分析：本研究通过STRING在线数据库分析ASPM蛋白的相互作用，发现多个蛋白与ASPM相互作用，其中包括BUB1、CENPE、KIF23、KIF11、DLGAP5、CCNA2、NCAPG、TTK、CDC20、CDK1 (图4)。结合GSEA分析结果，在细胞周期中， BUB1、CCNA2、TTK、CDC20、CDK1这些相关蛋白与ASPM表达上调有关。同时，在TIMER数据库中相关性分析显示，乳腺癌组织中ASPM与BUB1 (r=0.878，P=4.62e-320，图5A)、CCNA2 (r=0.848，P=3.11e-275，图5B)、TTK (r=0.851，P=3.08e-279，图5C) 都具有强相关性，与CDC20 (r=0.683，P=1.62e-137，图5D)和CDK1 (r=0.774,P=2.27e-199，图5E)也有一定的相关性。

图2 Kaplan-Meier法分析ASPM表达水平与乳腺癌预后的相关性A.GSE3494数据集；B.Kaplan-Meier Plotter在线数据库

图3 GSEA分析ASPM高表达的乳腺癌样本富集基因集A.细胞周期 (P=0.000；FDR=0.003；ES=0.68)；B.氧化磷酸化 (P=0.002；FDR=0.004； ES=0.60)；C.DNA修复 (P=0.000；FDR=0.003；ES=0.77)；D.错配修复 (P=0.000；FDR=0.008；ES=0.71)；E.剪接体 (P=0.010；FDR=0.008；ES=0.51)；F.蛋白酶体 (P=0.000；FDR=0.007；ES=0.73)

图4 String数据库中与ASPM相互作用的蛋白质

6.RT-qPCR验证ASPM mRNA在乳腺癌组织中的表达:本研究通过RT-qPCR检测了13对乳腺癌及癌旁组织中ASPM的mRNA表达情况，结果显示乳腺癌病灶组织中ASPM的表达水平显著高于其配对的癌旁组织，差异有统计学意义 (P<0.01, 图6)，与Oncomine数据库的分析结果一致。

讨 论

ASPM位于人类染色体1q31，编码由3477个氨基酸残基组成的蛋白质，在维持有丝分裂纺锤体功能的过程中发挥重要作用，与肿瘤的发生、发展密切相关[5]。ASPM基因可能参与了DNA损伤修复的相关过程，该基因的缺失会影响细胞有丝分裂、分裂方向和分化方式，造成DNA损伤增加和细胞凋亡[10]。最新的研究表明，ASPM在胶质母细胞瘤和恶性胶质瘤中过表达，干扰ASPM表达可以减少肿瘤细胞和神经干细胞的增殖[11～13]。ASPM与肝细胞癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的预后不良显著相关[14]。上述研究均提示，ASPM异常表达与癌症进展密切相关，然而ASPM表达与乳腺癌临床指标的相关性及预后的研究仍较为缺乏。

图5 TIMER数据库进行Spearman相关性分析A.ASPM与BUB1的相关性 (r=0.878，P=4.62e-320)；B.ASPM与CCNA2的相关性 (r=0.848，P=3.11e-275)；C.ASPM与TTK的相关性 (r=0.851，P=3.08e-279)；D.ASPM与 CDC20的相关性 (r=0.683，P=1.62e-137)；E.ASPM与CDK1的相关性 (r=0.774, P=2.27e-199)

图6 RT-qPCR验证ASPM在13对乳腺癌配对组织中mRNA的表达

本研究首先利用Oncomine数据库分析发现，与正常的乳腺组织比较，ASPM在乳腺癌组织中的表达异常升高。进一步对收集的乳腺癌配对组织进行RT-qPCR检测，发现与配对的癌旁组织比较，ASPM的mRNA水平在乳腺癌组织中显著上调。通过GSE3494数据集和TCGA数据库中临床资料完整的乳腺癌样本，回顾性分析发现，ASPM与多项临床指标显著相关。在两个数据库中均发现ASPM与ER水平、PR水平显著相关 (P=0.000)。ASPM与年龄仅在TCGA数据库中显著相关 (P=0.002)，可能是TCGA数据库包含有1090例乳腺癌患者，而GSE3494只含有251例，样本量不够大。此外，在GSE3494数据集中，ASPM与肿瘤直径、淋巴结浸润显著相关 (P=0.000)；在TCGA数据库中，ASPM与TNM分期中的T分期 (P=0.000)、N分期 (P=0.03)显著相关，与M分期 (P=0.724)无相关性，提示ASPM在乳腺癌的发生、发展中可能发挥癌基因的作用。通过GSE3494数据集中的乳腺癌患者的临床随访数据资料，发现ASPM高表达的乳腺癌患者预后较差。Kaplan-MeierPlotter在线数据库也证实了ASPM高表达患者的总体生存率显著低于ASPM低表达患者。这些结果提示ASPM表达水平升高与预后不佳有关，可作为乳腺癌预后评估的临床指标。

本研究进一步利用GSE3494数据集的251例乳腺癌样本进行基因富集分析，发现ASPM高表达与细胞周期、氧化磷酸化、DNA修复、错配修复、剪接体和蛋白酶体等基因集关系密切。多数肿瘤细胞常表现出染色体的改变，包括缺失、易位和多倍体等[15]。细胞周期是细胞增殖过程中的主要步骤，肿瘤的发生都有一个共同特征即细胞周期调控机制紊乱。而ASPM与细胞周期过程中的纺锤体功能密切相关，影响着细胞周期的进展，从而影响细胞的增殖[16]。ASPM还能与Cdk2/Cyclin E复合物相互作用，通过调节其泛素化、磷酸化和在细胞核内的定位来调节细胞周期蛋白的活性[17]。胃癌的起源细胞，缺乏特定的生物学标志物，唯一表达的转录因子E2F1，可以参与干细胞的自我更新和胃癌发展，其与ASPM密切相关，共同参与了关键细胞的调控机制，故ASPM可作为胃癌干细胞生物学标志物[18]。ASPM可以通过增强Wnt-β-catenin信号通路维持前列腺癌细胞的干性特征[19]。这些结果提示ASPM可能通过调节乳腺癌细胞的细胞周期及癌细胞的干性，影响乳腺癌的增殖能力，从而促进乳腺癌细胞的发生、发展。

综上所述，通过GSE3494数据库和TCGA数据库的分析，发现ASPM与乳腺癌多个病理指标有关，可以通过多种途径来促进肿瘤的进展，从而影响患者的临床预后水平，其有望成为预警乳腺癌不良预后的生物学标志物。然而，其促进肿瘤发生、发展的具体机制仍需要开展进一步研究。