二氢杨梅素对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用研究

王署美 王 琳 王 硕 李万忠 李海健 吕艳娜 赵春贞

二氢杨梅素(dihydromyricetin，DHM)是一种存在于天然植物中的多酚羟基双氢黄酮类化合物，广泛存在于葡萄科属植物，其药理作用广泛。研究发现，二氢杨梅素具有调节血脂、保护神经系统、保护心血管、抗炎等多种药理作用，可改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能[1～4]。目前二氢杨梅素对于H2O2诱导的PC12细胞损伤的作用尚未见报道。本研究利用H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤模型，探讨二氢杨梅素的作用效果及机制。

材料与方法

1.细胞及培养:大鼠高分化嗜铬瘤细胞PC12细胞株购自中国科学院上海细胞库，细胞采用高糖DMEM培养液，加10%的胎牛血清，于37℃、5% CO2条件下常规培养。

2.主要试剂：二氢杨梅素(DHM，HPLC≥98%)购自美国Sigma-Aldrich公司；高糖DMEM培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑蓝购自美国Sigma-Aldrich公司；乳酸脱氢酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33342购自美国Sigma-Aldrich公司；Bax、Bcl-2和caspase-3兔多克隆抗体，GAPDH小鼠多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800荧光标记的二抗购自美国LI-COR公司。

3.细胞分组及干预:细胞随机分组，分为正常对照组、模型组(100μmol/L H2O2)、DHM低剂量组(10μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低剂量组(20μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)、DHM低剂量组(40μmol/L DHM+100μmol/L H2O2)。PC12细胞采用DHM干预0.5h后，给予H2O2进行处理，24h后进行相关指标检测。

4.细胞活性检测:取对数生长期的PC12细胞，以5×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液，二氧化碳孵箱中培养24h后，加入终浓度10、20、40μmol/L的DHM溶液作用0.5h后，加100μmol/L的H2O2溶液继续培养24h。避光加入终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h后，加入100μl的DMSO，震荡10min使结晶充分溶解，于酶标仪检测570nm波长处的A值，计算细胞存活率，实验平行重复3次。细胞活性(%)=实验组平均值/对照组平均值×100%。

5.LDH检测:采用ELISA法测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量。取对数生长期的PC12细胞，按5×104个/孔接种于24孔细胞培养板中培养过夜。细胞随机分组，培养24h后收集上清液按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书操作说明测定LDH含量。LDH(%)=实验组平均值/对照组平均值×100%。

6.Hoechst 33342染色:取对数生长期的PC12细胞接种于24孔板，至于CO2孵箱37℃培养24h，等细胞贴壁后，将细胞随机分组，加终浓度为10、20、40μmol/L的DHM处理后0.5h，加100μmol/L的H2O2溶液处理，置于CO2孵箱继续培养24h，弃去培养液，用PBS洗涤2遍，每次5min，加冰甲醇固定10min，弃去固定液，用PBS清洗3遍，每次5min，加入10μg/ml的Hoechst 33342染色液，室温避光染色10min，弃掉染色液，用PBS清洗2遍，每次5min，吸弃液体，用碳酸甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态变化。显微镜下选取5个视野，计数凋亡细胞百分比取平均值。

7.Western blot法检测：细胞处理同上，24h后收集细胞，加适量细胞裂解液，冰上裂解30min，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，与加样缓冲液混合后100℃煮沸5min变性，采用10%的SDS-PAGE电泳、转膜，加7.5%脱脂牛奶封闭2h，加抗Bax、Bcl-2、caspase-3和GAPDH抗体孵育过夜，TBST清洗3遍，每次5min，加荧光二抗孵育2h，TBST清洗后，Odyssey红外荧光扫描系统扫描。采用Quantity One软件分析条带灰度变化。

结 果

1.DHM对PC12细胞活性和LDH释放的影响:MTT结果显示，H2O2对PC12细胞作用24h后，细胞存活率明显下降，与对照组比较，模型组细胞存活率显著下降(P<0.01)；与模型组比较，DHM 10、20、40μmol/L剂量组细胞存活率显著提高(图1，P<0.01)。与对照组比较，模型组细胞上清液中的LDH含量显著增高(P<0.01)，经DHM处理后，LDH含量显著下降(P<0.05)，表明DHM显著降低H2O2对PC12细胞的氧化损伤，详见图2。

2.Hoechst 33342观察DHM对细胞凋亡的影响：正常对照组PC12细胞的细胞核轮廓完整，细胞大且细胞核呈圆形，而凋亡小体少。H2O2处理后PC12细胞核明显固缩，DHM处理后细胞核固缩的细胞数量明显减少(图3A)。与对照组比较，H2O2组凋亡细胞百分比显著增高，经DHM 10、20、40μmol/L处理后，细胞凋亡百分比显著降低(图3B，P<0.01)。

3.PC12细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响:Western blot法结果显示，与对照组比较， 模型组PC12细胞中Bax和caspase-3蛋白表达显著增高，Bcl-2蛋白表达显著降低；与模型组比较，DHM 10、20、40μmol/L组Bax和caspase-3蛋白显著降低，Bcl-2蛋白显著增高，Bax/Bcl-2比例显著下降(图4)。

图1 二氢杨梅素对细胞存活百分比的影响与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P < 0.01

图2 二氢杨梅素对乳酸脱氢酶活性的影响与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

图3 Hoechst33342检测细胞凋亡的影响A.Hoechst染色图；B.凋亡率；与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；Bar=50μm

图4 Western blot法检测Bcl-2、Bax和caspase-3 表达的影响A.电泳图；B.Bax/GAPDH;C.Bcl-2/GAPDH;D.Bax/Bcl-2/;E.caspase-3/GAPDH;与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01；与H2O2组比较，#P<0.05, ##P<0.01

讨 论

二氢杨梅素是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎抗氧化等药理作用，尤其是抗氧化作用。多项研究证实，DHM通过抑制氧自由基的形成减少氧化应激诱导的细胞或组织损伤[5～7]。氧化应激增强诱导神经元凋亡坏死[8]。二氢杨梅素在中枢神经系统损伤中能够缓解氧化应激引起的损伤，可能对神经退行性疾病的治疗和预防发挥保护作用。本研究采用H2O2诱导PC12细胞氧化损伤，初步探讨二氢杨梅素保护PC12细胞氧化损伤的效果与机制。

中枢神经系统细胞氧需求高且存在大量对过氧化反应敏感的细胞，特别容易受到活性氧损伤。氧化应激在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病发病过程中发挥非常重要的作用[9, 10]。神经退行性疾病无法治愈，神经元细胞逐渐退化死亡导致运动或精神障碍。尽管它无法治愈，但神经退行性变的进展可被天然氧化剂阻断从而减缓神经元细胞的丢失。本研究采用MTT实验证实不同浓度二氢杨梅素增加了PC12细胞的存活率，保护PC12细胞免受H2O2损伤。LDH含量是检测细胞死亡的一个重要指标，H2O2诱导PC12细胞培养液中的LDH释放增加，而二氢杨梅素处理后细胞培养液中的LDH水平明显减少。上述实验结果证实二氢杨梅素对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤具有很好的保护作用。

大量研究表明H2O2诱导多种神经细胞凋亡，细胞外H2O2过量使氧化还原失衡，诱发氧化应激导致细胞凋亡[11]。笔者采用Hoechst染色结果显示，二氢杨梅素明显降低细胞凋亡百分比，表明二氢杨梅素能明显减轻H2O2诱导的细胞凋亡。Bcl-2是凋亡家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，与促凋亡蛋白Bax形成异源二聚体，作用于线粒体外膜，阻止线粒体释放caspase，来影响细胞凋亡[12,13]。为进一步研究二氢杨梅素的抗凋亡作用机制，Western blot法检测凋亡相关蛋白表达的结果显示，H2O2能够显著促进PC12细胞的Bax和caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下调，而二氢杨梅素能显著抑制促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白表达，诱导抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达上调。已有研究表明H2O2导致细胞毒性和caspase-3蛋白过表达，且多种黄酮类化合物通过抑制caspase-3减轻氧化应激诱导的细胞凋亡。

综上所述，本研究表明二氢杨梅素能够增加H2O2诱导的PC12细胞存活率，抑制细胞凋亡，并通过抑制caspase-3蛋白和Bax/Bcl-2比例，实现保护PC12细胞氧化损伤的效果。氧化应激导致神经细胞损伤是许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等发病的重要机制。二氢杨梅素作为广泛存在于天然植物的有效成分，对H2O2诱导PC12细胞的保护作用预示对神经退行性疾病的潜在疗效，是一种重要的药物前体成分。