miR-346靶向调控SFRP4介导5-FU诱导的结肠癌细胞毒性

张立川，李井野*，张 睿，王晓煜，石 刚

0 引言

结直肠恶性肿瘤在发展中国家的发病率呈现上升趋势，随着化疗及靶向治疗的发展，无病生存率及总生存率近年略有升高，但1/3结直肠恶性肿瘤初诊时即为晚期。化疗及靶向治疗仍然是晚期结直肠癌延长生存期综合治疗的主要方式。化疗及靶向治疗耐药是导致治疗终止及影响化疗效果的首要因素。对于化疗耐药及化疗敏感性增效的研究是目前结直肠恶性肿瘤的主要方向。微小RNA(miRNA)及其上下游通路蛋白在肿瘤耐药中具有重要的作用。5-FU是结直肠癌一线化疗的主导药物，5-FU的应用显著延长了晚期结直肠癌生存期，耐药是影响其治疗效果的重要原因。有研究显示，分泌型卷曲相关蛋白4(SFRP4，Secreted Frizzled-Related Protein 4)在消化系统恶性肿瘤(如胰腺癌及肠癌组织)中表达水平低于正常组织，与肿瘤的恶性行为呈现负相关，为抑癌基因[1-3]。另有研究显示，miR-346在肝癌及结直肠癌等恶性肿瘤组织中表达高于正常组织，为促癌基因[4-6]。本课题组前期研究显示，miR-346与SFRP4在结直肠癌细胞及组织中表达，二者呈负相关，经生物信息学预测，二者存在靶向调节关系[7-8]。二者是否在结肠癌5-FU耐药中具有调控作用，需进一步实验证明。本研究目的在于观察miR-346及SFRP4在结肠癌5-FU诱导毒性中的作用，并进一步观察二者的调控关系，为结肠癌5-FU化疗增敏及耐药逆转提供靶向候选基因。

1 材料与方法

1.1 材料 人SW480及HT-29结肠癌细胞购自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，美国)。细胞在含有10%胎牛血清(美国Invitrogen公司)和1%青霉素/链霉素(美国Invitrogen公司)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(美国Invitrogen公司)中培养。上调SFRP4表达的pcDNA3.1-SFRP4、NC(阴性对照，Negative control)、阴性对照miRNA(Con-miR)、空载体(Vector)及引物由Biomics生物技术有限公司(中国南通)设计合成。miR-346 mimics及miR-346 inhibitor购自Cell Signaling公司(美国)。Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)。蛋白酶抑制剂PMSF购自Sigma公司(美国)。凋亡检测试剂盒及MTT试剂盒购自Sigma公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 转染步骤 将SW480及HT-29细胞接种到24孔板中并孵育过夜。根据说明书，将pcDNA3.1-SFRP4、NC、Con-miR、miR-346、miR-346+Vector、miR-346+SFRP4等分别使用Lipofectamine 2000转染SW480和HT-29细胞。

1.2.2 Western blot法 以具有蛋白酶抑制剂PMSF的冷RIPA缓冲液提取SW480及HT-29细胞的总蛋白。通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质裂解物，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用5%脱脂奶粉在PBST中封闭2 h，然后在4 ℃下一抗孵育过夜，TBST洗膜3次后加二抗，在室温下孵育1 h，给予化学发光，采用QuantityOne计量灰度值进行统计分析。

1.2.3 细胞活力测定 采用MTT法评估细胞活力。将SW480及HT-29细胞细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板培养基中孵育过夜。然后，用指定浓度的(400、800、1 200、1 600、2 000 μg/ml)5-FU处理细胞。在37 ℃孵育48 h后，向每个孔中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，再孵育4 h。除去上清液后，加入150 μl二甲基亚砜。通过酶标仪测量波长490 nm处的吸光度来评估细胞活力。转染后的SW480及HT-29细胞也按如上程序处理。

1.3 流式细胞术分析 使用凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。将5×105转染的SW480及HT-29细胞接种到6孔板中，分别给予不同浓度的5-FU处理48 h。随后，收集细胞，用PBS洗涤3次，并重悬于100 μl结合缓冲液中。然后将细胞用5 μl FITC和5 μl PI在室温下双染15 min。使用流式细胞仪分析凋亡细胞。

2 结果

2.1 miR-346及SFRP4对5-FU诱导的结肠癌细胞毒性的影响 MTT法结果表明，与空白对照(0 μg/ml)对比，给予不同浓度梯度(400、800、1 200、1 600、2 000 μg/ml)5-FU培养48 h的SW480及HT-29结肠癌细胞的细胞存活率均下降，为剂量依赖性，在1 200、1 600、2 000 μg/ml浓度差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A。

与NC组相比，上调SFRP4表达或5-FU处理后，SW480和HT-29细胞存活率均下降，而上调SFRP4表达与5-FU同时处理后细胞活力降低最为显著，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1B。

CCK-8结果显示，与Con-miR组相比，外源性miR-346不改变细胞存活率，与Con-miR+5-FU组比较，miR-346+5-FU共同干预后，SW480和HT-29细胞活力降低减少，表明miR-346降低了5-FU对结肠癌细胞的毒性。分别与miR-346+5-FU、miR-346+Vector组比较，miR-346+SFRP4+5-FU共同干预后，SW480和HT-29细胞活力降低有改善，表明SFRP4可能逆转miR-346对5-FU细胞毒性降低的作用，见图1C。

图1 miR-346及SFRP4对5-FU诱导的结肠癌细胞毒性的影响

以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU诱导的SW480及HT-29细胞毒性，而miR-346能够降低5-FU诱导的SW480及HT-29细胞毒性。

2.2 miR-346及SFRP4对5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡的影响 流式细胞结果显示，与NC组比较，上调SFRP4表达的pcDNA3.1-SFRP4组诱发未经5-FU处理的SW480、HT-29细胞凋亡增加，与pcDNA3.1-SFRP4组或NC组比较，pcDNA3.1-SFRP4组联合1 200 μg/ml 5-FU处理的SW480和HT-29细胞凋亡进一步增加(P<0.05)，见图2A。结果表明，上调SFRP4表达促进5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡。与Con-miR组相比，外源性miR-346不改变细胞凋亡率，与Con-miR+5-FU组比较，miR-346+5-FU共同干预后，SW480和HT-29细胞凋亡减少。结果表明，miR-346降低了5-FU对结肠癌细胞凋亡的作用，分别与miR-346+5-FU、miR-346+Vector组比较，miR-346+SFRP4+5-FU共同干预后，SW480和HT-29细胞凋亡率降低有所改善，表明SFRP4可能逆转miR-346对5-FU细胞凋亡的作用，见图2B。以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU诱导的SW480及HT-29细胞凋亡，而miR-346能够降低5-FU诱导的SW480及HT-29细胞凋亡。

2.3 miR-346对SFRP4表达具有负向调控作用 Western blot检测显示,与NC组比较，给予miR-346 mimics干扰的SW480及HT-29细胞SFRP4蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3A。给予miR-346 inhibitor干扰的SW480及HT-29细胞SFRP4蛋白表达上升，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3B。

3 讨论

氟尿嘧啶类药物在结直肠癌晚期治疗、新辅助治疗及辅助治疗中均为一线推荐药物，部分患者原发耐药，部分患者随着化疗次数累加而产生多药耐药，5-FU是胸腺合成酶抑制剂，错配修复能力的强化、药物产生代谢障碍及细胞内的DNA损伤等因素都是化疗耐药的因素。miRNA对上游或下游的靶基因具有调控作用，这些靶基因可能位于化疗敏感或耐药的通路上，从而对化疗增敏或耐药产生影响。在前期研究中，结肠癌组织及细胞层面显示miR346在结肠癌组织及细胞中表达高于正常上皮细胞及正常结肠组织，SFRP4在结肠癌组织及细胞中低于正常上皮细胞及结肠组织，二者具有相关性。经生物信息学预测，进一步显示二者具有靶向调控关系[7-8]。

图2 miR-346及SFRP4对5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡的影响

注：A.上调miR-346表达对SW480及HT-29细胞凋亡的影响，

B.miR-346对SW480及HT-29细胞凋亡的影响

图3 Western blot检测给予miR-346 mimics (A)或miR-346 inhibitor (B)干扰的SW480及HT-29细胞SFRP4蛋白表达

本研究显示，给予5-FU培养的SW480及HT-29结肠癌细胞的细胞存活率下降，为剂量依赖性。上调SFRP4表达后，经5-FU处理的SW480和HT-29细胞存活率会明显下降，SFRP4对5-FU化疗具有增效作用。miR-346及5-FU共同干预SW480和HT-29细胞后，细胞降低减少，表明miR-346降低了5-FU对结肠癌细胞的毒性；同时给予miR-346、SFRP4共同干预5-FU诱导的细胞毒性，细胞活力降低有改善，表明SFRP4可能逆转miR-346对5-FU细胞毒性降低的作用。结果表明，SFRP4可以增加5-FU诱导的SW480及HT-29细胞毒性，而miR-346能够降低5-FU诱导的SW480及HT-29细胞毒性。

本研究进一步观察了miR-346及SFRP4在5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡的作用，结果显示，上调SFRP4表达对5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡具有增效作用，而miR-346具有相反的作用。二者共同作用于5-FU诱导的结肠癌细胞，细胞凋亡率略有回升，表明SFRP4可能逆转miR-346对5-FU细胞凋亡的作用。以上研究表明，SFRP4可以增加5-FU诱导的SW480及HT-29细胞凋亡，而miR-346能够降低5-FU诱导的SW480及HT-29细胞凋亡。宋敏等[9]研究了miR-215-3p在结肠癌5-FU耐药中的作用，结果显示，miR-215-3p通过调控下游CXCR4逆转5-FU耐药。陈淑兰等[10]研究显示，miR-19a通过靶向调控TP53INP1介导5-FU诱导的结肠癌耐药。另有研究显示，miR-340及miR-139-5p对结肠癌化疗耐药均有调控作用[11-12]。这些研究均表明，miRNA在肿瘤耐药中发挥重要作用。miRNA在肿瘤发生、发展、预后分析、预测及治疗方面均有重要的作用。Yagi等[13]在液体活检中采用ex-miRNA-125b监测在进展期结直肠癌化疗中mFOLFOX6方案耐药，结果显示，miRNA-125b可以有效监测化疗期间肿瘤耐药，可作为肿瘤进展的早期标志物及预后因素。miR-34a、miR-143、miR-153、miR-27a及miR-218等在结直肠肿瘤化疗耐药中的作用也得到多项实验证实，miRNAs发挥化疗耐药的下游通路及基因包括PI3K/Akt、EMT、p53、p21及ATM等[14]。

本研究结果显示，miR-346对SFRP4表达具有负向调控作用，但其属于直接调控作用还是间接调控，需进一步实验证明。miR-346通过负向调控SFRP4降低5-FU诱导的结肠癌细胞毒性，但是否具有靶向应用价值，需进一步实验证明。