毛细管气相色谱法测定磺丁基醚-β-环糊精中杂质1,4-丁烷磺内酯

李闻新，张雪柏，律 涛，王 巧

0 引言

磺丁基醚-β-环糊精(Betadex sulfobutyl ether sodium,SBE7-β-CD)是一种新型药用辅料，具有水溶性好、肾毒性低、溶血作用小等优点，可增加药物的溶解度和稳定性，提高生物利用度，掩盖不良气味等，已广泛用于药物注射剂、口服制剂等新包合物的研究[1-2]。SBE7-β-CD是由1,4-丁烷磺内酯(1,4-butane sultone,1,4-BS)在碱性条件下与β-环糊精(β-CD)的2,3,6位碳上的羟基发生取代反应而得到的[3-4]。由其合成工艺可知，1,4-丁烷磺内酯是合成SBE-β-CD的原料，由于其具有弱致癌性[5-6]，必须严格限制其含量。王双等[7]采用分散液液微萃取-气相色谱法对1,4-BS进行含量测定研究，但该方法样品处理繁琐、操作复杂，仅可作为实验室研究，不能用于实际工作中的检测。本试验在该研究的基础上对SBE7-β-CD中的1，4-BS进行测定研究，并比较了标准曲线法和外标一点法的准确度，通过优化供试品处理等条件总结出了更为简便的方法，提高了工作效率。

1 仪器与试药

1.1 仪器 天美GC7900气相色谱仪(上海天美科学仪器有限公司)，配有火焰离子化检测器，D7900P色谱工作站；空气源SPB-3型(北京中惠普分析技术研究所)；旋涡混合器XW-80A型(上海医科大学仪器厂)。

1.2 试药 1,4-BS(美国Sigma公司，纯度>99%)；二乙砜(美国Sigma公司，纯度97%)；SBE7-β-CD对照品为USP标准品(批号：F0K026，纯度100%)；SBE7-β-CD供试品(由唐山市第二医院中心实验室提供，批号：20131104，20131105，20131106)；二氯甲烷(分析纯，天津光复科技发展有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：DB1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm，Agilent Technologies)；氢火焰离子化检测器；载气为氮气(纯度99.999%)，燃气为氢气，助燃气为空气；载气流速30 ml/min；进样口温度为200 ℃；柱温为程序升温：初始温度100 ℃，以10 ℃/min的升温速率升到200 ℃，再以30 ℃/min的升温速率升到260 ℃，恒温3 min；检测器温度为270 ℃；柱前压为9.9 psi；分流比为10∶1；进样量1 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液 取1,4-BS对照品约12 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加水溶解，定容。精密量取此溶液1 ml，置25 ml量瓶中，用水定容，得浓度为48 μg/ml的对照品储备液。

2.2.2 内标储备液 取二乙砜约2 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加水溶解，定容。精密量取此溶液5 ml，置10 ml量瓶中，用水定容，得浓度为40 μg/ml的内标储备液。

2.2.3 供试品溶液 取SBE7-β-CD供试品约0.2 g，精密称定，置10 ml离心管中，精密加入水1 ml，涡旋溶解，再精密加入二氯甲烷1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，得供试品溶液。

2.3 专属性试验 取1,4-BS对照品约12 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加适量二氯甲烷溶解，定容，精密量取此溶液1 ml，置25 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得浓度为48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液。再精密量取此溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得浓度为4.8 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液。

取二乙砜约2 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加适量二氯甲烷溶解，定容，精密量取此溶液5 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得浓度为40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液。再精密量取此溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得浓度为4.0 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液。

分别量取48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液和40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液各1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，即得1,4-BS和二乙砜混合溶液。

精密量取水1 ml，置10 ml离心管中，再精密加入二氯甲烷1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，得萃取水二氯甲烷溶液。

取二氯甲烷空白溶剂、4.8 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液、4.0 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液、1,4-BS和二乙砜混合溶液、萃取水二氯甲烷溶液和供试品溶液，按“2.1”项下方法分别进样，二乙砜与1,4-BS的保留时间分别为6.131 min和8.615 min，分离度远大于1.5，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好，色谱图见图1。

2.4 检测限和定量限、线性范围 取1,4-BS对照品储备液并逐级稀释、处理，分别进样，分别以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品的量为检测限和定量限，1,4-BS的检测限和定量限分别为0.112 6 ng和0.259 9 ng。

分别精密量取1,4-BS对照品储备液0.64、0.84、1.06、1.26、1.46、1.88 ml，分别置10 ml量瓶中，再分别精密加入内标储备液1 ml，用水定容，得1,4-BS系列对照品溶液，浓度分别为2.984、3.979、4.973、5.968、6.963、8.952 μg/ml，内标的浓度均为4.0 μg/ml。精密量取各对照品溶液1 ml，分别置10 ml离心管中，再分别精密加入二氯甲烷溶液1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，进样分析，记录色谱图和峰面积。以1,4-丁烷磺内酯与内标的峰面积比(S1,4-BS/S二乙砜，Y)对1,4-丁烷磺内酯的浓度(X)进行线性回归。

图1 专属性试验色谱图

1,4-BS的标准曲线方程为：Y=0.315 4X-0.057 7，r=0.998 9，表明1,4-BS在2.984～8.952 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度和准确度 取SBE7-β-CD供试品约0.2 g，共9份，按“2.2.3”项方法分别制备供试品溶液，按色谱条件进样分析，记录色谱图和峰面积，以标准曲线法计算，9份SBE7-β-CD供试品中均未检测到杂质1,4-BS。

取SBE7-β-CD供试品约0.2 g 3份，精密称定，分别置10 ml离心管中，依次精密加入高、中、低3种浓度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的“2.5”项下的1,4-BS标准溶液1 ml(内标浓度为4.0 μg/ml)，涡旋溶解，再分别精密加入二氯甲烷溶液1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，进样分析，记录色谱图和峰面积，以标准曲线法计算，即为测得量。每种浓度平行制备3份。回收率计算公式：(测得量-原有量)/加入量×100%，计算高、中、低3种浓度时的回收率和RSD。

高、中、低3种浓度的平均回收率分别为101.5%、99.3%、100.3%，RSD为1.6%、1.2%、1.2%，表明该方法的重复性和准确度良好。

2.6 仪器精密度 取7.008 μg/ml的1,4-BS对照品溶液(内标浓度为4.0 μg/ml)，重复进样6次，记录色谱图，计算峰面积比(S1,4-BS/S二乙砜)的RSD。测得1,4-BS与二乙砜峰面积比的RSD为4.6%，表明仪器精密度良好。

2.7 溶液稳定性 取SBE7-β-CD供试品约0.2 g，精密称定，置10 ml离心管中，精密加入7.008 μg/ml的1,4-BS标准溶液1 ml(内标浓度为4.0 μg/ml)，涡旋溶解，再精密加入二氯甲烷溶液1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，分别在室温下放置0、2、4、8 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算RE%值。RE%值按如下公式进行计算：(某小时浓度-0 h浓度)/0 h浓度×100%，见表1。结果表明，样品溶液在8 h内稳定。

表1 样品溶液稳定性试验结果

2.8 萃取率 分别精密量取“2.5”项下高、中、低3种浓度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的标准溶液1 ml(内标浓度为4.0 μg/ml)，分别置10 ml离心管中，再分别精密加入二氯甲烷1 ml，涡旋1 min，静置分层，取有机相，进样分析，记录色谱图和峰面积，即得一次萃取峰面积。重复操作3次。

精密量取48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液和40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液适量，配制成高、中、低3种浓度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的二氯甲烷溶液(内标浓度为4.0 μg/ml)，分别进样，记录色谱图和峰面积，即得直接溶解峰面积。依此法重复操作3次。

萃取率按如下公式计算：一次萃取峰面积/直接溶解峰面积×100%，计算高、中、低3种浓度时的萃取率和RSD。

1,4-BS高、中、低3种浓度的平均萃取率分别为81.6%、73.0%、71.8%，RSD分别为14.3%、5.4%、6.3%；二乙砜高、中、低3种浓度的平均萃取率分别为59.0%、62.4%、50.5%，RSD分别为10.9%、7.6%、10.2%，表明一次萃取能够满足定量的要求，见表2。

表2 萃取回收率试验结果(静置分层)

2.9 1,4-BS的含量测定 3批SBE7-β-CD供试品(20131104，20131105，20131106)按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，利用已建立的标准曲线，计算3个批号的SBE7-β-CD中1,4-BS含量。3个批次SBE7-β-CD供试品中均没有检测到杂质1,4-BS。

3 讨论

3.1 分析方法与检测器的选择 1,4-BS为淡黄色黏稠液体，属磺酸内酯类化合物，水溶性低(54 g/L，20 ℃)。由于1,4-BS无紫外吸收，所以不能使用常规的紫外检测器进行分析。笔者曾尝试采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定1,4-BS，结果未出现色谱峰，推测可能是因为1,4-BS的沸点较低(153 ℃，19 kPa)，与反相色谱常用流动相水、甲醇的沸点相差不大，因此在蒸发光散射检测器中易与流动相一起挥发，不能很好地形成可产生散射的小液滴。根据1,4-BS沸点较低的特点，之后选择毛细管气相色谱方法进行研究。考虑到1,4-BS中含有硫原子，最初采用对硫原子专属的火焰光度检测器(Flame photometric detector，FPD)进行检测。但试验中发现1,4-BS在FPD检测器中的淬灭效应非常严重，导致灵敏度极低，改用FID检测器进行检测，结果满意。

3.2 供试品不脱水与脱水处理的考察 本试验采用从水中萃取供试品的处理方法。二氯甲烷溶剂色谱图基线较平滑，而萃取水后所得有机相则出现了一些杂峰，见图1a、e。笔者考察了供试品溶液经无水硫酸钠脱水处理与不经脱水处理的情况，发现两种情况下色谱图无明显差异。因此可以判定萃取水后出现的杂质峰并非由水蒸汽产生的，而是由水中的杂质产生的。由于目前的方法还不能除去水中的杂质，因此试验中供试品处理方法无需采用无水硫酸钠的脱水处理。

3.3 标准曲线法与外标一点法的比较 本研究在计算精密度和准确度的同时也比较了外标一点法与标准曲线法的准确性。标准曲线法高、中、低3种浓度中1,4-BS含量测定结果的RSD分别为1.6%、1.2%、1.2%，平均回收率分别为101.5%、99.3%、100.3%；外标一点法高、中、低3种浓度中1,4-BS含量测定结果的RSD分别为1.5%、1.1%、1.2%，平均回收率分别为98.4%、100.0%、102.4%。两种方法所得结果无明显差异，因此在今后试验中可以考虑采用更为简便的外标一点法。

3.4 萃取后分层方法的比较 试验还考察了萃取后静置分层(约15 min)和离心分层(9 500×g)的效果。静置分层时二乙砜高、中、低3种浓度的平均萃取率分别为59.0%、62.4%、50.5%，RSD分别为10.9%、7.6%、10.2%；离心分层时二乙砜高、中、低3种浓度的平均萃取率分别为56.1%、57.7%、52.8%，RSD分别为18.8%、24.8%、13.9%。可见，静置分层比离心分层的稳定性更好，故选择静置分层的处理方法。

4 结论

本试验通过优化色谱条件和供试品处理方法，建立了快速、准确测定SBE7-β-CD中的杂质1,4-BS的方法，可用于其质量控制。