茯苓液体发酵培养条件优化

张诗泉，郭毓菲，汪芷玥，曾百慧，王茜，吴鹏*

黄冈师范学院生物与农业资源学院，经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，大别山特色资源开发湖北省协同创新中心（黄冈 438000）

茯苓（Poria cocos）又称茯灵，属多孔菌科[1]。我国森林资源非常丰富，很多地域具有海拔高、昼夜温差大、雨水量充沛的特点，适宜真菌类中药材种植和生长[2]。茯苓作为中国传统药材，具有抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老、消炎利尿等作用[3]。随着茯苓研究深入[4]，茯苓及其提取物被广泛应用于医药和保健品研发[5]。因此，消费者对于茯苓的需求量不断增加[6]，使得茯苓具有广阔市场前景[7]。

中国对于茯苓的培养仍以人工栽培的传统方法为主[8]，存在生长周期长、效益低、局限于地理条件[9]、不能够确保茯苓药性等诸多问题[10]，不符合现代工业化生产要求[11]，不利于茯苓资源开发。而茯苓液体发酵培养技术具有周期短、成本低、工艺简单、产量大的优势[11-14]，采用茯苓液体发酵培养技术获得的茯苓与人工栽培的茯苓具有相同功效，还能获得标准化茯苓以满足工业化生产需求[15]，茯苓液体发酵培养将成为茯苓资源开发趋势[16-17]。

试验以茯苓菌丝体干质量作为衡量标准，用液体发酵培养法对茯苓菌进行培养，选择培养温度、接种量、培养天数为影响因素，通过单因素及响应面试验对茯苓液体发酵培养条件进行优化，为实现现代工业化生产优质茯苓提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与试剂

茯苓菌（甘油管保藏-30℃）。

葡萄糖、硝酸钠、无水氯化钙、维生素B1（VB1）、磷酸氢二钾、硫酸镁（均为分析纯）；蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）。

1.1.2 培养基

种子液体培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，在121℃条件下灭菌20 min。

初始发酵培养基：葡萄糖40 g/L，硫酸镁1.67 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸钠5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，VB11 g/L，无水氯化钙0.1 g/L，在121℃条件下灭菌20 min[18]。

1.2 仪器与设备

LX-B 50L型立式自动电热压蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；RB-CJ-1 ND型超净工作台（北京瑞邦兴业科技有限公司）；SPX-150生化培养箱（中仪国科（北京）科技有限公司）；TG 16-WST台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；D2F-6020真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；AL 204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）股份有限公司）；SHA-C数显水浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化、纯化及种子液

活化。将甘油保藏的茯苓菌用37℃水浴2 h，将水浴后的茯苓菌用无菌移液枪按2%接种量种于种子液体培养基内进行液体发酵，在26.5℃恒温培养箱中培养3 d。

纯化。把活化后的菌种按10%接种量接种于250 mL种子液体培养基中，在26.5℃的恒温培养箱中培养3 d。3 d后重复此操作以得到纯度高的菌种进行培养和后续优化试验。

种子液。将50 mL种子液体培养基装入250 mL三角瓶中，在超净工作台中按5%接种量无菌接种，置于26.5℃的恒温培养箱中培养3 d，作为菌体菌种备用。

1.3.2 菌体量的测定

将所得发酵液，导入离心管中以4 000 r/min离心20 min，去上层清液，将剩于物质置于45℃真空干燥箱中干燥至恒质量，称质量，以干菌体量表示生物量[19]。

1.3.3 茯苓液体发酵最佳培养的研究

将50 mL发酵培养基装入250 mL三角瓶中，按5%接种量接入已培养好的菌种，用恒温水浴摇床振荡培养，转速150 r/min，培养温度26℃，培养3 d。

接种量对茯苓液体发酵的影响。依此以3%，5%，7%，9%和11%接种量在水浴温度26℃、振荡速度150 r/min条件下培养3 d，测定各三角瓶菌体量，确定茯苓液体发酵最适接种量。

培养天数对茯苓液体发酵的影响。以5%接种量在水浴温度26℃、振荡速度150 r/min条件下依此培养2，3，4，5和6 d，测定各三角瓶菌体量，确定茯苓液体发酵最适培养时间。

摇瓶温度对茯苓液体发酵的影响。以5%接种量在水浴温度分别为24，25，26，27和28℃，振荡速度150 r/min条件下培养3 d，测定各三角瓶菌体量，确定茯苓液体发酵最适培养温度。

1.3.4 响应面分析试验设计

在单因素试验的基础上，得到Box-Behnken试验的中心点，以相邻的上下2个梯度为高低水平，以菌体量（Y）为响应值，对茯苓菌体量的影响因素培养温度（A）、接种量（B）、培养天数（C）进行响应面分析试验，得到最优方案。响应面设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 培养温度对茯苓液体发酵的影响

试验结果见图1。培养温度对菌丝体干质量有较大影响，达到26℃前，随着温度升高，菌丝体干质量不断增加，在26℃时由最大菌丝体干质量，为7.34 g/L；温度大于26℃后，菌丝体干质量逐渐下降。由于在不同温度下微生物有不同生理活性，因而确定最适培养温度26℃。

图1 不同培养温度对茯苓液体发酵的影响

2.1.2 接种量对茯苓液体发酵的影响

试验结果见图2。随着接种量增加，菌丝体干质量增加，接种量5%～7%时，菌丝体产量较高，5%时菌丝体干质量为5.02 g/L达到峰值，综合考虑培养时间长短和生产成本等因素后，确定最适接种量5%。

2.1.3 培养天数对茯苓液体发酵的影响

试验结果见图3。培养天数对菌丝体干质量有较大影响，培养天数4～6 d时有较高菌丝体干质量，并且在5 d时达到最大值7.4 g/L，培养天数大于5 d时菌丝体干质量开始下降，综合考虑成本后，选择最适培养天数5 d。

图2 不同接种量对茯苓液体发酵的影响

图3 不同培养天数对茯苓液体发酵的影响

2.2 响应面试验优化

2.2.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 8.0软件，以菌丝体干质量为（Y）作为响应值，对培养温度（A）、接种量（B）和培养天数（C）3个因素进行三因素三水平的Box-Behnken试验，Box-Behnken试验设计及结果见表2，回归模型方差分析结果见表3。

将各因素使用Design-Expert 8.0软件进行二次多项式回归拟合后，得到茯苓菌丝体干质量响应面回归模拟方程：Y=7.34+0.044A-0.35B-0.16C-0.36AB+0.91AC+1.37BC+0.78A2-0.64B2-2.01C2。

由表3可知，该模型的p=0.000 1＜0.01，极显著；失拟项p=0.077 0＞0.05，不显著，表明该方程合理可靠。一次项B对结果影响显著（p＜0.05），A、C对结果影响不显著（p＞0.05），交互项AC、BC对结果影响极显著（p＜0.01），AB对结果影响不显著（p＞0.05），二次项A2、C2对结果影响极显著（p＜ 0.01），B2对结果影响显著（p＜0.05）。3个单因素对菌丝体干质量的影响主次顺序为B＞C＞A，即：培养天数＞接种量＞培养温度。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

由响应面分析法求得茯苓菌发酵培养的最佳条件为：培养温度27℃、接种量3.86%、培养天数4.99 d。理论得到菌丝体干质量为8.358 78 g/L。考虑试剂操作方便，将各因素修正为：培养温度27℃、接种量4%、培养天数5 d。

2.2.2 响应分析

培养温度、接种量及培养时间的交互作用对菌丝体干质量影响的响应面及等高线见图4。

图4直观反映影响菌丝体干质量的3个因素两两交互作用，随着培养温度、培养时间和接种量增加，菌丝体干质量呈先升高后下降趋势，在所采用数值间均有极值出现。沿接种量（B）方向比培养天数（C）的响应面坡度更陡，等高线也更密集，说明接种量对茯苓液体发酵培养的影响大于培养天数，与方差分析结果一致；培养天数（C）方向比培养温度（A）的响应面坡度更陡，说明培养天数对茯苓液体发酵培养的影响大于培养温度，与方差分析结果一致。

图4 培养温度、接种量及培养时间的交互作用对菌丝体干质量影响的响应面及等高线

2.2.3 验证试验

在由响应面分析法求得的茯苓液体发酵培养的最佳条件下进行验证试验，通过3次平行试验，得出实际菌丝体干质量为8.329±0.032 g/L，与回归方程预测值8.358 78 g/L基本吻合，所以该模型有效。

3 结论

试验结果表明，茯苓液体发酵培养不仅和菌种基因等内在因素有关，也与菌体培养温度、培养时间、接种量等外在条件有关。试验以茯苓液体发酵培养后菌丝体干质量为响应值，利用响应面对茯苓液体发酵培养的条件进行优化，试验结果表明，接种量显著影响茯苓液体发酵培养的结果。得出最佳培养条件为：培养温度27℃、接种量4%、培养天数5 d。接种量和培养天数的交互作用、培养温度和培养天数的交互作用对试验结果影响均显著，但是接种量和培养温度的交互作用对试验结果影响不显著，后续研究可考虑更换培养温度这一条件，以期得到最佳茯苓液体发酵培养条件，为茯苓液体发酵工业化生产提供理论基础。