重型/危重型新型冠状病毒肺炎患者多种生物样本核酸检测结果分析

吴建国，罗建飞，刘家盛，刘 丹，邓 俊，钱志成，胡利萍，李士军，肖 喆，王旭峰，彭志洋，闫瑞承1武汉大学人民医院 东院感染性疾病五病区，湖北武汉 000；武汉大学人民医院 东院胃肠外科，湖北武汉 000；四川大学华西医院 呼吸科，四川成都 10000；西南医科大学附属医院 呼吸科，四川泸州 000；川北医学院附属医院 重症医学科，四川南充 7000；新疆医科大学第一附属医院 感染科，新疆乌鲁木齐 80001

2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种由新型冠状病毒(2019-nCoV)感染导致的急性重症肺炎，自2019年12月以来，在湖北省武汉市陆续发现，并随后向全国蔓延，世界部分地区也呈现暴发趋势[1-2]。COVID-19主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，也存在经气溶胶传播的可能[3]。钟南山院士团队发现部分患者的粪便及尿液样本中2019-nCoV核酸检测呈阳性并成功分离出活的2019-nCoV[4-5]。提示2019-nCoV也有可能通过粪-口传播。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和病毒基因测序为诊断COVID-19金标准，目前主要采集鼻咽拭子样本进行检测。本研究拟利用实时荧光定量RT-PCR方法检测确诊患者不同类型生物样本，阐述2019-nCoV在人体内不同系统、不同阶段的分布特点及其临床意义。

对象与方法

1 研究对象 纳入2020年1月31日- 2020年2月19日武汉大学人民医院东院(武汉市危重症COVID-19定点收治医院)感染性疾病五病区收治的重型/危重型COVID-19确诊患者共19例。COVID-19诊断标准：依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》，符合相关流行病学、临床表现，鼻咽拭子实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性，COVID-19病例分型为重型和危重型[3]。

2 生物样本采集 本研究纳入病例入院时鼻咽拭子2019-nCoV核酸均为阳性。入院治疗两周后由主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集COVID-19病例的鼻咽拭子、痰液、血液、粪便、肛门拭子样本作为复查。

3 试剂和仪器 采用华大基因生产的2019-nCoV核酸检测试剂盒及核酸提取试剂盒。核酸提取采用DA3200核酸提取仪，产物扩增采用ABI7500型PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific)。

4 核酸提取及产物扩增 采用磁珠法提取核酸，试剂盒含磁珠结合液、磁珠洗涤液、洗脱液及蛋白酶K。根据中国疾病预防控制中心推荐选用针对2019-nCoV病毒的ORF1ab和核壳蛋白N基因区域的引物和探针。

5 结果判定 首先分析内标在HEX通道是否有扩增曲线，且扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数(cycle threshold，Ct)。若内标在HEX通道检测到Ct或Ct≤40，则表示本次检测有效，可继续进行后续分析：1)若FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，则判定该结果为2019-nCoV核酸检测为阳性；2)若FAM及ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线(未检测到Ct)，或Ct＞40，则表示2019-nCoV核酸检测为阴性；3)若内标在HEX通道没有检测到Ct或Ct＞40，则表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新实验。

6 统计学方法 一般统计学描述。

结 果

1 纳入患者一般情况 纳入19例确诊的重型/危重型COVID-19，其中男10例，女9例；平均年龄67(51 ～86)岁；根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》评估分型，重型17例，危重型2例。

2 不同样本核酸检测阳性率 19例COVID-19确诊病例治疗两周后接受不同生物样本的2019-nCoV核酸检测，结果如下：复查鼻咽拭子核酸检测阳性率42.10%(8/19)，痰液核酸检测阳性率68.42%(13/19)，血液核酸检测阳性率5.26%(1/19)，粪核酸检测阳性率21.05%(4/19)，肛拭子核酸检测阳性率10.52%(2/19)。多样本阳性患者病情较重，且转归较差(病例2，病例8)。多样本阴性患者(病例4，病例15)症状缓解。见表1。

讨 论

2019-nCoV病毒核酸检测阳性是COVID-19病例的病原学确诊依据，目前多采用上呼吸道鼻咽拭子作为核酸检测样本，而其他生物样本行临床报告较少。本研究发现，复查鼻咽拭子2019-nCoV核酸检测阳性率42.10%(8/19)，同时检测到痰液2019-nCoV核酸检测阳性率68.42%(13/19)。在重型/危重型COVID-19患者中，呼吸道2019-nCoV核酸检测阳性率较高，其中下呼吸道痰液2019-nCoV核酸检测阳性率明显高于上呼吸道鼻咽拭子。有相关文献报道2019-nCoV主要是通过S1-蛋白与人肺部ACE2受体结合侵入人体细胞，在肺部高表达ACE2的细胞83%是Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT2)[6-9]。而Ⅱ型肺泡上皮细胞主要分布在下呼吸道，这与COVID-19临床上以下呼吸道症状为主相符合。由此我们推测下呼吸道可能是2019-nCoV的主要靶器官。临床工作中肺泡灌洗液标本因采集难度大、增加采集者感染风险，通常不建议常规使用(气管切开、呼吸机辅助呼吸病例除外)。因此我们建议同时检测鼻咽拭子和痰液核酸检测以提高准确率，减少假阴性率。

表1 19例治疗2周后不同类型生物样本的2019-nCoV核酸检出结果Tab.1 2019-nCoV detection results in 19 severe/critically ill patients from different specimens after two-week treatment

本研究同时发现粪便2019-nCoV核酸检测阳性率21.05%(4/19)，肛门拭子核酸检测阳性率10.52%(2/19)，提示COVID-19有粪-口传播可能。ACE2不仅在肺细胞，而且在消化道上皮细胞中也高表达，提示消化道也可能是2019-nCoV感染的潜在靶器官，消化道核酸检测值得关注[10-11]。在临床治疗过程中，我们发现患者的消化道症状比较罕见，而粪便/肛拭子阳性患者，其痰液阳性率亦较高，可能为2019-nCoV经呼吸道分泌物吞进消化道所致，但也不排除消化道黏膜屏障损伤导致。因此2019-nCoV是否侵入消化道需要进一步深入研究。本研究发现部分COVID-19病例呼吸道(鼻咽拭子/痰液)核酸检测阴性而消化道核酸(粪/肛拭子)检测却呈阳性，提示消化道2019-nCoV清除时间较呼吸道延迟，而目前根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》单纯两次连续(采样时间间隔至少1 d)呼吸道核酸检测阴性作为出院标准[3]。患者假阴性出院和出院后复阳的风险较高，因此是否将消化道(粪便/肛门拭子)核酸检测纳入出院标准值得探讨，对患者出院后严格的隔离及复查有一定的参考意义。

本研究还发现1例COVID-19患者血液样本2019-nCoV核酸检测阳性。血液中存在活性病毒或病毒核酸片段都有可能导致核酸检测阳性，但目前尚未见到血液中分离出2019-nCoV的报道，血液是否具有传染性有待进一步研究。本研究发现两例危重型患者多样本2019-nCoV核酸检测均呈阳性，并且后期病情转归较差，其原因可能是病毒滴度较大，多器官受累导致；而两例多样本核酸检测均呈阴性COVID-19患者，其症状缓解及肺部炎症渗出吸收较为理想，提示COVID-19患者多样本核酸检测阳性率可能与患者病情程度有关。

综上所述，本研究发现重型/危重型COVID-19病例呼吸道病毒核酸检测阳性率较高，其中痰液检测阳性率高于鼻咽拭子，呼吸道2019-nCoV转阴的病例其消化道2019-nCoV检测仍存在一定阳性率，血液是否具有传染性有待进一步研究。进行多种生物样本病毒核酸检测能提高2019-nCoV检出率、降低出院病例假阴性率。