榆黄蘑菌丝体多糖提取工艺研究

张宝翠，朱玉昌,2，王应玲，陈莉莉，姜 宁,2*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族大学)，湖北 恩施 445000；3.湖北省地质局第二地质大队，湖北 恩施 445000)

榆黄蘑(Pleurotuscitrinopileatus)又称为金顶侧耳、玉皇蘑，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是珍贵的药食同源经济菌之一[1].具有多种生理药理活性物质[2-3]，其中多糖是主要的活性成分之一[4]，具有免疫调节[5]、抗氧化性[6]、抗炎[7]等生物活性.

药食同源真菌人工驯化有着悠久的历史，固体基质人工栽培与液体深层发酵相辅相成.采用深层发酵培养由于占地小、成本低廉、生产周期短且菌龄可保持高度一致，所以采用深层发酵获得药食同源真菌菌丝体，并进一步提取有效活性成分、对活性成分进行深层次研究已成为当今的热点[8-10].无论子实体还是菌丝体，食用菌多糖一般采用水浴醇沉法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、蛋白酶辅助提取法等，各种提取方法各有优势.提高多糖得率除优化提取外，还可采用诱导菌丝体生长的方法[11].榆黄蘑多糖的提取工艺研究大多限于子实体，对榆黄蘑菌丝体多糖的提取及功能研究较少.本研究以榆黄蘑菌丝体为研究对象，对菌丝体多糖提取的工艺进行优化，为榆黄蘑的深层次开发利用提供试验依据.

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榆黄蘑(Pleurotuscitrinopileatus)菌种购自江苏省江都天达食用菌研究所，由生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族大学)保存.蒽酮、VB1、KH2PO4，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，武汉市中天化工有限责任公司；其余试剂均为分析纯.

1.2 培养基

菌种活化培养基：马铃薯 20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.1%，琼脂2%，pH值自然，100 mL蒸馏水.

种子液培养基：菌种活化培养基不加琼脂，分装于250 mL锥形瓶，装液量为100 mL，无菌封口膜封口，用于制备深层发酵种子液.

深层发酵培养基：1%葡萄糖，3%黄豆粉，3%可溶性淀粉，0.1%磷酸二氢钾，0.01%维生素B1，pH值自然，100 mL蒸馏水.

1.3 仪器与设备

BSD-YX2200智能精密摇床，上海博讯实业有限公司；YGF300/50L发酵罐,上海洋格生物工程设备有限公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司.

1.4 试验方法

1.4.1 种子液及菌丝体的制备 将冻存菌种接入平板活化培养基，28 ℃培养10 d后，无菌条件下，用直径0.5 cm打孔器打孔菌种平板，接入液体种子液培养基中，150 r/min 26 ℃震荡培养5～7 d.再将种子液接种于发酵罐中发酵，温度为26 ℃，接种量为10%，DO 40%～60%，150 r/min培养7 d.将培养好的菌丝体用4层纱布清洗过滤，真空冷冻干燥，粉碎过60目筛，备用.

1.4.2 葡萄糖标准曲线的绘制 采用蒽酮-硫酸比色法[12]测多糖含量.以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线.

1.4.4 单因素试验 ①液固比对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响.称取榆黄蘑菌丝体粉末，分别按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)加入蒸馏水70 ℃浸提2 h，3 500 r/min离心20 min，取上清.按1.4.3操作测多糖含量，计算得率.②提取时间对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响.称取榆黄蘑菌丝体粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸馏水，70 ℃分别浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，3 500 r/min离心20 min，取上清.按1.4.3操作测多糖含量，计算得率.③提取温度对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响.称取榆黄蘑菌丝体粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸馏水，分别在40、50、60、70、80、90 ℃浸提2 h，3 500 r/min离心20 min，取上清.按1.4.3操作测多糖含量，计算得率.④提取次数对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响.称取榆黄蘑菌丝体粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸馏水70 ℃浸提2 h，3 500 r/min离心20 min，取上清.残渣按上述方法再分别提取1、2、3、4次，合并提取的上清液，按1.4.3操作测多糖含量计算得率.

1.4.5 正交试验及验证 根据单因素试验结果，采用L9(34)正交表进行正交试验，因素水平设计见表1.

根据正交试验结合方差的结果确定提取最优组合，设置3个平行组，测定多糖得率，验证结果可靠性.用SPSS和origin 8.0软件对数据进行处理，数据多重比较采用Tukey法.

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖糖标准溶液的质量浓度与吸光度的关系，如图1.葡萄糖在0～80 μg/mL的范围内，R2=0.999 5，回归方程为y=6.908 4x-0.004 3(y为吸光度，x为葡萄糖质量浓度).

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of Glucose

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液固比对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响 液固比对榆黄蘑菌丝体多糖得率有影响(图2)，液固比5∶1(g/mL)和10∶1(g/mL)时，多糖得率无显著性差异.但在10∶1(g/mL)升至20∶1(g/mL)时，菌丝体多糖得率不断提高.当液固比大于20∶1(g/mL)后，菌丝体多糖得率开始下降.这是因为随着溶剂用量的增加，多糖有效溶出增大，但当液固比达到一定程度时，多糖已基本溶出，不会继续增大，且随着提取液体积的增大，使提取损耗加大反而使得率有所下降.根据单因素试验结果，选择液固比15∶1、20∶1、25∶1(g/mL)3个水平进行正交试验研究.

2.2.2 提取时间对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响 随着时间的增加，菌丝体粗多糖得率不断升高，在2.5 h后时得率增加不明显，反而有减少趋势，这说明在一定范围内增加浸提时间，多糖的溶出度增大，但是到达一定程度时，物料中多糖与溶剂中多糖含量已达到稳定状态，同时杂质也可能溶出，致使多糖得率下降(图3).因此，选择2.0、2.5、3.0 h三个水平进行正交试验研究.

2.2.3 提取温度对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响 提取温度对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响结果如图4所示，在40～60 ℃时，由于温度较低，分子运动速率缓慢，溶质溶出不充分，多糖得率变化不明显.在60～90 ℃时菌丝体多糖得率不断升高，因为温度的升高，细胞分子运动速率提高，使得多糖扩散、溶出速率提升，因此多糖的得率提高.但当温度超过80 ℃后，多糖得率不再显著增加，这是因为温度过高会使多糖结构遭到破坏.多糖得率在80 ℃与90 ℃条件下无显著性差异，因此，选择70、80、90 ℃三个水平进行正交试验研究.

2.2.4 提取次数对榆黄蘑菌丝体多糖得率的影响 提取次数会影响榆黄蘑菌丝体多糖得率(图5)，提取次数的增加会使多糖得率不断升高，但当浸提次数超过4次时，多糖得率反而有所下降.这说明浸提3次时，多糖已能够充分溶出，浸提次数过多，反而使得其他水溶性物质的溶出，也会影响多糖得率.因此，选择前3个水平进行正交试验研究.

2.3 正交试验与验证结果分析

根据正交试验结果(表2)可知，影响榆黄蘑菌丝体多糖提取的主次因素为A>C>D>B，最优组合是A3B3C3D3，即提取3次、液固比25∶1(mL/g)、提取温度90 ℃、提取时间3 h.根据方差分析结果(表3)可知，提取次数与提取温度对多糖得率有极显著的影响(P<0.01)，提取时间对多糖得率有显著的影响(P<0.05)，液固比对多糖得率无显著影响.根据F值大小得出影响菌丝体多糖主次因素为A>C>D>B，这与极差分析结果相同.由于极差分析，B3与B1相差仅0.56，考虑降低能耗，节约成本，液固比确定为B1，即最优条件为A3B1C3D3.

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交试验结果方差分析Tab.3 Analysis of variance of results of orthogonal test

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01.

根据最优结果A3B1C3D3，即提取3次、液固比15∶1(mL/g)、提取温度90 ℃、提取时间3 h，对榆黄蘑菌丝体多糖提取进行验证试验，多糖提取得率达4.55%，结果表明该工艺稳定可靠.

3 讨论

水提醇沉法已广泛应用于各类真菌多糖的提取[12-13]，衣铭慧等[14]与石堃等[15]均优化了榆黄蘑子实体多糖提取工艺，虽然得率达到8.0%以上，但由于栽培子实体工艺要求高、占地大、周期长等导致生产成本显著高于菌丝体生产，所以多糖的生产成本依然高于本实验.蔡德华等[16]曾采用超声辅助提取法优化了榆黄蘑新鲜菌丝体多糖提取工艺，得到的优化工艺：超声波破壁时间12 min，提取时间4 h，提取温度70 ℃，菌丝密度250 mg/mL(鲜重)，得率为2.99%.与上述研究相比，本研究采用的是烘干后的菌丝，在工业化生产上更具有指导意义，虽然提取温度较高，但减少了设备投入，缩短了提取时间，提高了得率.

本研究对榆黄蘑菌丝体多糖的提取工艺进行了研究，优化了水浴提取的工艺条件.确定了榆黄蘑菌丝体多糖的最佳提取工艺，为榆黄蘑的进一步开发利用提供了实验依据.