上调LncRNA RP11-173C1.1对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖和侵袭能力的影响

王群，袁杰，黄军，梅虹

0 引言

我国是甲状腺癌高发国家之一，其发生率逐年上升[1]。虽然甲状腺癌的治疗手段近年来得到了较快发展，但其具体发病机制至今仍不明确。甲状腺癌的发生发展是多分子通路参与的复杂过程，寻找甲状腺的分子靶点是近年来研究热点[2]。长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA,lncRNA）最初被认为是基因组的“转录噪音”，无生物学功能，然而近年来大量研究证实lncRNA在人类包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展中发挥重要作用[3]。lncRNA数量众多，只有少数lncRNA在甲状腺癌中被研究报道[4]。RP11-173C1.1是一种新确定的lncRNA。本研究通过分析RP11-173C1.1在甲状腺癌组织和细胞株中的表达量，探究RP11-173C1.1在甲状腺癌发生发展中的作用，并通过上调甲状腺癌细胞中RP11-173C1.1的表达，探讨上调RP11-173C1.1干扰甲状腺癌细胞增殖和侵袭的作用机制，为靶向lncRNA治疗甲状腺癌提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2016年6月—2018年7月湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心42例甲状腺癌手术切除的癌组织和相应的癌旁组织标本，于液氮中冷冻保存。男7例、女35例,年龄20～62岁，平均（38.28±5.37）岁。甲状腺乳头状癌37例，甲状腺滤泡癌5例。临床分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期14例、Ⅲ期8例。手术标本均经该院病理科专家确认。所有患者术前均未行放化疗，本研究经本院伦理委员会同意，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞与主要试剂

胎牛血清、DMEM/F12培养基和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。引物（RP11-173C1.1、GAPDH、miR-376c-3p、U6和OPCML）购自上海生物工程股份有限公司。一抗OPCML、α-Tubulin、CDK2、Cyclin E2、MMP-2 和MMP-9及二抗均购自美国CST公司。甲状腺乳头状癌细胞（B-CPAP、SW579）、滤泡状癌细胞（TPC-1、MDA-T32、TT）和正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。阴性对照质粒及RP11-173C1.1表达载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司。qRT-PCR相关试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.3 RNA提取和实时荧光定量PCR

42例组织标本和细胞株均采用TRIzol氯仿提取法提取总RNA。根据TaKaRa试剂盒说明书配制反应体系进行qRT-PCR检测，RP11-173C1.1上游引物为：5’-GGTTAGTGCAGGCCTCTCG-3’，下游引物为：5’-GGAGCGCCTTAGTGGAAGTT-3’；GAPDH上游引物为：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，下游引物为：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；OPCML上游引物为：5’-ATCTCTGACATCAAGCGAGACC-3’，下游引物为：5’-CTTCTGACCGACTGAAAC ACC-3’；miR-376c-3p上游引物为：5’-GGGGAACATAGAGGAAATT-3’，下游引物为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系为：20 µl。扩增参数：94℃预变性10 min，60℃ 25 s，72℃ 25 s，40个循环。利用2-ΔΔCt方法计算，以U6为内参检测miR-376c-3p的表达，以GAPDH为内参检测RP11-173C1.1和OPCML mRNA的表达。

1.4 细胞培养及质粒转染

B-CPAP、Nthy-ori3-1和MDA-T32细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，TPC-1、SW579和TT细胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F 1 2 培养基培养，细胞均在培养箱（3 7 ℃、5%CO2）中培养。根据LipofectamineTM3000说明书进行转染，分别转染携带无意义序列的阴性对照质粒（对照组）和RP11-173C1.1表达质粒（实验组），以对数生长期的B-CPAP细胞为转染对象。常规培养转染细胞24 h后，更换新鲜RPMI 1640培养基。

1.5 CCK-8检测转染后B-CPAP细胞增殖

胰酶消化、收集对照组和实验组对数生长期的B-CPAP细胞，制成细胞悬液，以2×103个/孔（200 µl）细胞接种于96孔板，隔天换液。检测时，每孔加入15 μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，使用酶标仪测定在450 nm波长处每组细胞的吸光度（OD）值，每天检测1次，连续监测5天。

1.6 Transwell侵袭实验检测转染后B-CPAP细胞侵袭

采用Matrigel胶（15 μg/ml）均匀铺在Transwell上室，待其凝固后，胰酶消化、收集对照组和实验组对数生长期的B-CPAP细胞，无血清RPMI 1640培养基制成细胞悬液，以4×104个/室（每室200 µl）细胞接种于Transwell上室。Transwell下室加600 µl含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养24 h后弃去培养基，1 ml 4%多聚甲醛固定20 min，1 ml 0.1%结晶紫染色20 min。流水轻轻洗去染液，棉签擦去未穿过孔膜的B-CPAP细胞。倒置显微镜下，取多个视野计数穿膜细胞数，取均值后统计分析。

1.7 生物信息学技术预测RP11-173C1.1的作用机制

利用LncBase Predicted v.2软件预测RP11-173C1.1互补结合的miRNA，利用TargetScan Release 3.1软件预测miRNA互补结合的基因。

1.8 Western blot实验检测OPCML蛋白的表达水平

胰酶消化、收集、裂解对照组和实验组对数生长期的B-CPAP细胞，提取总蛋白后制备蛋白样品50 µg。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，蛋白上样恒压（100 V）电泳，聚偏氟乙烯膜恒流（200 mA）转膜。5%脱脂牛奶封闭80 min，一抗：OPCML（1:1 000稀释）、CDK2（1:1 000稀释）、Cyclin E2（1:2 000稀释）、MMP-2（1:500）、MMP-9（1:500）及α-Tubulin（1:500），4℃孵育过夜。采用二抗在室温下孵育80 min，ECL显影液显影，凝胶成像系统拍照。

1.9 统计学方法

使用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，定量资料采用均数±标准差（±s）表示，以独立样本t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RP11-173C1.1在甲状腺癌组织和细胞株中低表达

qRT-PCR结果显示，RP11-173C1.1在42例甲状腺癌组织中的表达量与癌旁组织相比明显下降（1.20±0.32vs.4.82±0.84,P=0.007）；与正常甲状腺滤泡上皮细胞株Nthy-ori3-1细胞相比，RP11-173C1.1在甲状腺癌细胞株SW579细胞（P<0.001）、TT细胞（P<0.001）、B-CPAP细胞（P<0.001）、TPC-1细胞（P=0.001）、MDA-T32细胞（P=0.002）中的表达量明显下降，其中在B-CPAP细胞中下降的最显著，见图1。

2.2 转染RP11-173C1.1表达质粒促进B-CPAP细胞中RP11-173C1.1表达

转染RP11-173C1.1表达质粒后48 h，qRT-PCR结果显示，实验组B-CPAP细胞中RP11-173C1.1表达量与对照组相比明显增加（10.39±0.80vs.1.00±0.03,P<0.001）。

图1 RP11-173C1.1在甲状腺癌细胞株和正常甲状腺滤泡上皮细胞中的表达水平Figure 1 Expression levels of RP11-173C1.1 in thyroid cancer cell lines and normal thyroid follicular epithelial cells

2.3 上调RP11-173C1.1抑制B-CPAP细胞的增殖

CCK-8法检测结果显示，在第2、3、4、5天，上调RP11-173C1.1的实验组B-CPAP细胞OD值明显低于对照组（P=0.026、P=0.002、P<0.001、P=0.003），表明上调RP11-173C1.1可抑制B-CPAP细胞的增殖能力，见图2。

图2 上调RP11-173C1.1对B-CPAP细胞增殖能力的影响Figure 2 Effect of RP11-173C1.1 overexpression on proliferation of B-CPAP cells

2.4 上调RP11-173C1.1明显抑制B-CPAP细胞的侵袭

Transwell侵袭实验结果显示，实验组B-CPAP细胞穿过底膜的细胞数明显少于对照组（43.06±13.41vs.106.60±14.08个，P=0.017），表明上调RP11-173C1.1可抑制B-CPAP细胞的侵袭能力，见图3。

2.5 生物信息学软件预测RP11-173C1.1下游分子机制

采用LncBase Predicted v.2软件预测显示，RP11-173C1.1可互补结合miR-376c-3p；TargetScan Release 3.1软件预测显示，miR-376c-3p可互补结合OPCML mRNA，见图4。

2.6 上调RP11-173C1.1对B-CPAP细胞中miR-376c-3p和OPCML mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，实验组B-CPAP细胞中miR-376c-3p mRNA表达水平明显低于对照组（0.20±0.02vs.1.00±0.03,P<0.001），OPCML mRNA表达水平明显高于对照组（1.00±0.02vs.5.90±0.74,P<0.001），表明上调RP11-173C1.1可下调miR-376c-3p mRNA的表达，上调OPCML mRNA的表达。

2.7 上调RP11-173C1.1对OPCML蛋白表达的影响

Western blot结果显示，上调RP11-173C1.1后，OPCML蛋白表达水平升高，B-CPAP细胞周期调控蛋白如CDK2、Cyclin E2的表达水平降低，B-CPAP细胞侵袭调控蛋白如MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，表明上调RP11-173C1.1后B-CPAP细胞增殖和侵袭能力降低，见图5。

图5 上调RP11-173C1.1对B-CPAP细胞OPCML相关蛋白表达的影响Figure 5 Effect of RP11-173C1.1 overexpression on expression of OPCML-related proteins in B-CPAP cells

3 讨论

lncRNA是一类转录本长度>200个核苷酸的长链非编码RNA，在人体多种生命过程中具有重要调节作用[5]。肿瘤的发生发展是多步骤、多因素作用的复杂过程，lncRNA参与调控染色质重塑、基因转录等多种生物学功能，在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移等过程发挥抑癌基因或癌基因的作用[6]。CCND2-AS1、SPRY4-IT、HOTTIP、SNHG12等lncRNA与甲状腺癌的发生发展密切相关，促进甲状腺癌的增殖和侵袭，发挥癌基因的作用[7-9]。H19、GAS8-AS1、LINC01186等lncRNA是甲状腺癌重要的分子标志物，通过抑制癌基因的表达、干扰甲状腺癌的增殖和侵袭、发挥抑癌基因的作用[10-12]。然而，RP11-173C1.1是一种新发现的lncRNA，其在甲状腺癌中的表达和作用机制尚不明确。

本研究qRT-PCR结果表明，在甲状腺癌组织中RP11-173C1.1的表达水平较癌旁组织明显下调，提示RP11-173C1.1的低表达可能参与甲状腺癌的发生、发展。本研究通过CCK-8法和Transwell侵袭实验表明，上调RP11-173C1.1可干扰甲状腺癌细胞增殖和侵袭能力。“海绵效应”是lncRNA调节下游基因表达的重要作用机制，通过互补结合对应的微小RNA（miRNA），抑制miRNA的表达[13]。miRNA可在转录后抑制靶基因mRNA的翻译或者直接导致其降解。lncRNA抑制miRNA表达后，可干扰miRNA对靶基因miRNA的抑制作用，从而促进靶基因mRNA的表达[14]。生物信息学方法结果显示，RP11-173C1.1可互补结合miR-376c-3p，miR-376c-3p可互补结合阿片类结合蛋白/细胞黏附样分子（opioid binding protein/cell adhesion molecule like,OPCML）。Wang等[15]研究发现，miR-376c-3p在肝癌组织和细胞株中表达明显升高，与肝癌的不良预后密切相关，miR-376c-3p可促进肝癌细胞的生长和转移，发挥致癌作用。本研究结果表明，过表达RP11-173C1.1可明显降低甲状腺癌细胞中miR-376c-3p的表达。OPCML基因位于人类染色体11q25区域，通过激活腺苷酸环化酶调节细胞间黏附和细胞生长的作用[16]。OPCML表达缺失与乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，被鉴定为抑癌基因，具有抑制肿瘤生长和转移生长的作用[16-18]。本研究结果表明，RP11-173C1.1降低miR-376c-3p的表达后，OPCML基因的表达明显增加，表明RP11-173C1.1可能是通过靶向负调控miR-376c-3p，间接促进OPCML基因的表达，从而抑制甲状腺癌的进展。OPCML基因表达上调后，B-CPAP细胞周期调控蛋白，如CDK2、Cyclin E2的表达水平下调，B-CPAP细胞侵袭调控蛋白，如MMP-2和MMP-9蛋白表达下调，表明B-CPAP细胞增殖和侵袭能力降低。

综上所述，本研究证实RP11-173C1.1在甲状腺癌组织和甲状腺癌细胞株表达下调。在B-CPAP细胞中，RP11-173C1.1可能首先影响miR-376c-3p的表达,随后上调OPCML的表达，发挥抑制甲状腺癌细胞增殖和侵袭的作用。RP11-173C1.1有望成为一种具有重要潜在价值的肿瘤分子靶标。