一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法

惠瑶瑶，郑斐，王倩楠，安贤惠*

1(江苏海洋大学，江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港，222005) 2(南京百斯杰生物工程有限公司，江苏 南京，211100)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，EC1.1.3.4 GOD)是一种黄素蛋白(flavoprotein)，能够以分子氧为电子受体，将β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸内酯与过氧化氢(H2O2)[1-3]。葡萄糖氧化酶具有催化效率高、无毒副作用、高度专一性等特点，并能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而起到去除葡萄糖、脱氧、杀菌等效果[4]，因而被广泛地应用于医药生产[5-6]、食品加工[7-10]、饲料添加[11-12]等方面。

目前测定葡萄糖氧化酶的方法主要有滴定法、电化学法和分光光度法[13-16]。滴定法试剂成本低，但反应体系较大，操作繁琐，灵敏度低，结果误差较大[16]。电化学法易受溶液中溶氧以及电化学活性物质的干扰，检测结果不稳定[13]。分光光度法常用的供体有邻联茴香胺、4-氨基安替比啉酚类化合物等，存在显色物质不稳定，标准曲线重复性差，测定值偏低等问题[14]。目前最被广泛接受的检测方法是邻联茴香胺-辣根过氧化物酶偶联的分光光度法(双酶法)，但邻联茴香胺存在致癌风险，且辣根过氧化物酶价格较贵，导致检测成本较高。

本方法借鉴了过氧化氢酶含量检测方法[17]以及碘-淀粉体系显色原理[18-21]，以β-D-葡萄糖为底物，利用葡萄糖氧化酶特异性催化作用，生成中间产物过氧化氢；过氧化氢可与钼酸铵、KI反应生成单质碘；单质碘在酸性条件下与可溶性淀粉反应生成蓝色物质，该蓝色物质在一定浓度范围内，颜色深浅与酶活力呈正相关，从而建立一种新的葡萄糖氧化酶活性测定方法——碘-淀粉分光光度法。并与目前酶制剂企业采用较多的双酶法进行了比较研究。

1 主要仪器与试剂

1.1 主要仪器

Metash UV系列紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HH-601超级恒温水浴锅，金坛市天竟实验仪器厂；Eppendorf移液器、Eppendorf Centrifuge5424R离心机，艾本德中国有限公司；Mettler ME204E分析天平、Mettler FiveEasy Plus pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Vortex-5涡旋混合仪，其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 主要试剂与溶液配制

葡萄糖(Sigma)；可溶性淀粉(湖州展望药业有限公司)；邻联茴香胺(ACROS)；辣根过氧化物酶(Vetec V900603-100MG)；H2SO4(体积分数95%～98%)。

除特殊说明外，本文所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T 6682—2008中规定的二级水。

1.2.1 乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2 mol/L)

准确称取无水乙酸钠13.90 g，溶于900 mL去离子水中，搅拌至完全溶解，加入乙酸调节pH至5.50，用去离子水定容至1 L。

1.2.2 KI溶液(100 g/L)

准确称取10.000 g KI，溶于80 mL 乙酸-乙酸钠缓冲液中(1.2.1)，搅拌至完全溶解，用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100 mL。避光存储，现配现用。

1.2.3 葡萄糖溶液(180 g/L)

准确称取18.000 g葡萄糖，溶于80 mL水中，搅拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.4 钼酸铵溶液(100 g/L)

准确称取10.000 g四水合钼酸铵，溶于80 mL水中，搅拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.5 可溶性淀粉溶液(20 g/L)[22]

准确称取2.000 g(精确至0.001 g)可溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓慢加入70 mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100 mL。溶液现配现用。

1.2.6 柠檬酸溶液(1 mol/L)

准确称取一水合柠檬酸21.014 g，溶于80 mL水中，搅拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.7 邻联茴香胺溶液(10 g/L)

称取0.100 g邻联茴香胺，加入10 mL甲醇充分溶解，有效期3 d。使用时取1 mL加入到120 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 5.50)中，混匀备用，现配现用。

1.2.8 辣根过氧化物酶溶液(0.3 g/L)

准确称取辣根过氧化物酶3 mg，溶于10 mL水中。

1.2.9 H2SO4溶液(200 g/L)

准确称取200.0 g H2SO4液体，缓慢倒入水中，边倒边搅拌，冷却至室温，用水定容至1 L。

2 实验方法

2.1 测定方法与酶活力计算

2.1.1 碘-淀粉分光光度法

(1)标准曲线的制作

对市售体积分数30%过氧化氢溶液进行标定后，用水稀释配制成质量浓度(ρ)分别为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL(n=7)的过氧化氢标准液。取洁净试管7支，依次编号0～6。在试管中依次加入2.5 mL KI溶液、0.3 mL葡萄糖溶液、0.1 mL钼酸铵溶液、0.1 mL淀粉溶液以及0.1 mL上述不同质量浓度过氧化氢标准溶液，混匀后加入2 mL柠檬酸溶液。在570 nm处用1 cm光径比色皿比色，以0号管为对照，记录不同质量浓度过氧化氢标准液对应的吸光值。以显色体系中过氧化氢终质量浓度(ρ/51)为横坐标，对应吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(2)样品的测定

取洁净试管若干，在试管中依次加入2.5 mL KI溶液、0.3 mL葡萄糖溶液、0.1 mL 钼酸铵溶液、0.1 mL 淀粉溶液，混匀置于37℃水浴中预热3 min，间隔加入0.1 mL样品稀释液，准确计时反应3 min。加入2 mL柠檬酸溶液结束反应。分光光度计570 nm可见光下使用1 cm光径比色皿比色。空白管以0.1 mL缓冲液或热失活的酶液代替。

酶活性定义：在37 ℃、pH 5.50条件下，每分钟从0.1 mol/L 的β-D-葡萄糖溶液体系中释放出1 μmol 过氧化氢，即为1个葡萄糖氧化酶活力单位(U)。

酶活力按公式(1)计算：

(1)

式中：酶活力单位为 U/g或U/mL；ΔA，样品吸光值与空白吸光值的差值；K，H2O2标准曲线斜率；b，H2O2标准曲线截距；3，酶促反应时间，min；34，H2O2质量浓度，g/L；5.1，反应体系总体积，mL；0.1，加样量体积，mL；N，试样总稀释倍数。

2.1.2 双酶法

取洁净试管若干，在试管中依次加入2.5 mL邻联茴香胺溶液，0.3 mL 葡萄糖溶液，0.1 mL 辣根过氧化物酶溶液，混匀置于37℃水浴中预热3 min，间隔加入0.1 mL样品稀释液，准确计时反应3 min，加入2 mL H2SO4溶液终止反应。分光光度计460 nm可见光下使用1 cm光径比色皿比色。

酶活力按公式(2)计算：

(2)

式中：葡萄糖氧化酶的活性单位为U/g或U/mL；ΔA,样品吸光值与样品空白吸光值的差值;5,反应体系总体积，mL；3,反应时间，min；0.1,加样量体积，mL；m,样品质量或体积，g或mL；F,体积稀释倍数(试样总稀释倍数N=F/m)；11.3,消光系数，mL/(μmol·cm)。

2.2 实验样品处理

市售葡萄糖氧化酶固体样品1个，实验室摇瓶发酵液体样品1个以及市售葡萄糖氧化酶液体样品1个，编号为S1、S2、S3。

葡萄糖氧化酶固体样品首先需要预处理，即用乙酸-乙酸钠缓冲液(1.2.1)称取质量稀释50倍，磁力搅拌器涡旋10 min，10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液进行后续体积稀释，完成后编号备用。液体酶制剂直接用乙酸-乙酸钠缓冲液进行体积稀释，完成后编号备用。

3 结果与分析

3.1 碘-淀粉分光光度法

3.1.1 碘-淀粉分光光度法标准曲线的绘制

按照2.1.1方法绘制碘-淀粉标准曲线，得到标准曲线方程Y=0.789 3X-0.047 9，r=0.999 7。其中X为显色体系中过氧化氢终浓度，Y为对应吸光值，r为相关系数。

3.1.2 碘-淀粉分光光度法测定供试样品

碘-淀粉分光光度法检测样品S1、S2和S3的酶活力结果依次为6 753、2 986、10 842 U/mL；体系吸光值有效范围在0.1～0.6。葡萄糖氧化酶浓度控制在0.1～0.5 U/mL时，检测平行性良好，相对酶活力检测偏差在5%以内，结果如表1、表2和表3所示。

3.2 碘-淀粉分光光度法与双酶法的比较

3.2.1 两种方法检测结果比较

碘-淀粉分光光度法酶活力测定值显著高于双酶法。分析表1、表2和表3可知，碘-淀粉分光光度法的检测值约为双酶法的2～3倍。比较2组方法对同一组样品的检测结果，可以看出碘-淀粉分光光度法更容易检出样品中的葡萄糖氧化酶成分。

3.2.2 两种方法吸光值有效范围比较

将同一份样品进行梯度稀释，得到梯度酶浓度稀释液。在酶促反应体系中，随着酶浓度增大，酶活计算结果呈降低趋势。呈现该趋势的主要原因是随着酶活力增大，底物对于酶活力不再绝对过量，反应对准一级反应动力学有所偏离[16]。分析表1～表3，碘-淀粉分光光度法在检测固体样品S1、发酵液样品S2以及液体成品S3时，酶促反应体系与H2O2响应曲线在0.1～0.6的吸光值区间匹配良好，酶活力检测结果相对偏差5%以内；双酶法在吸光值0.1～0.2附近检测结果良好，酶活力计算结果相对偏差10%以内。对于成分组成不同的样品，吸光值范围略有波动。

表1 两种方法同时检测固体样品S1的数据比较Table 1 Comparison of two methods for simultaneousdetermination of solid sample S1

注：碘-淀粉分光光度法酶活力计算结果相对偏差超出5%时，数据加括号以示区别。双酶法酶活力计算结果相对偏差超出10%时，数据加括号以示区别，加括号数据不纳入表格参数计算;“-”：超出分光光度计仪器可信区间(0.1～0.8)，未计入检测数据(下同)

3.2.3 两种方法显色灵敏度比较

以表2发酵液检测结果为例，2种方法同时测定编号为9 ～ 12对应的酶梯度稀释液时，碘-淀粉分光光度法随着稀释倍数增大，吸光值由0.857递减至0.468，而双酶法从0.190递减至0.100。比较吸光值递减程度可知，碘-淀粉分光光度法的显色灵敏度高于双酶法。

综合表1～表3，碘-淀粉分光光度法酶活力计算结果的变异系数RSD均低于双酶法，说明碘-淀粉分光光度法的检测精确度高于双酶法。碘-淀粉分光光度法的最小检测限远低于双酶法，更有利于研发阶段对基因改造后酶蛋白微量表达菌株的筛选工作。

表2 两种方法同时检测摇瓶发酵液体样品S2的数据比较Table 2 Comparison of two methods for simultaneousdetection of liquid sample S2 in shaking flaskfermentation

表3 两种方法同时检测液体样品S3的数据比较Table 3 Comparison of two methods for simultaneousdetection of liquid sample S3

3.3 其他

实验中发现，双酶法的检测受辣根过氧化物酶影响较大，不同厂家和批号的辣根过氧化物酶，其检测结果和检测稳定性差异明显；碘-淀粉分光光度法检测误差与淀粉的选取有一定关系，本文实验选取湖州展望药业有限公司生产的酶制剂检测专用可溶性淀粉，配制过程中煮沸时间定为2～3 min，独立重复实验(n≥3)结果平行性良好。

4 结论

本文利用碘-淀粉显色体系建立了一种新的分光光度法检测葡萄糖氧化酶活力，体系吸光值有效范围在0.1～0.6附近。反应体系在葡萄糖氧化酶浓度为0.1～0.5 U/mL范围时，检测平行性良好，独立重复实验酶活力计算结果相对偏差在5%以内。碘-淀粉分光光度法所用试剂均为常见试剂，检测通量较高，检测精度满足需求，检测成本较低，通过反复验证，酶活力反应体系实用可靠。