过表达乙酰-CoA相关基因提高出芽短梗霉liamocins合成能力

郑鹏，张孟娟，黄思瑶，康新玥，陈叶福*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457) 2(工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学)，天津，300457)

出芽短梗霉为类酵母真菌，由于产生黑色素所以被称为黑酵母[1]，具有相当重要的生物技术意义、良好的抗环境压力能力，越来越受到医学方面的关注。出芽短梗霉因生长环境的不同而具有5种形态：酵母状细胞、芽孢子、肿胀孢子、菌丝状细胞和厚垣孢子[2]。出芽短梗霉因可以生产多种胞外酶[3-4]、单细胞蛋白、铁载体[5]、短梗霉素、普鲁兰糖[6]、聚苹果酸[7]和重油[8]等多种产物而闻名，并且能应用于生物防治[9]。其中普鲁兰糖是由其合成的一种胞外多糖，它由麦芽三糖以α-(1→6)糖苷键反复连接而成，特殊的化学结构赋予普鲁兰糖优良的性质，它黏度大、水溶性极强，在化工、食品、医药等行业应用广泛，可作为增稠剂，也能用于生产可被微生物降解的薄膜，还可作为低卡路里食品直接食用[10]。

Liamocins的生产首先由RUINEN等[11]报道，通过20号和272号出芽短梗霉生产。liamocins这个词是PRICE等[12]在确定了这个新化合物家族的详细结构后首次使用的。liamocins由一个部分乙酰化的多元醇头基团和1～5个3,5-二羟基癸酸酯基尾组成，在第1个3,5-二羟基癸酸中有可能会有3-O-乙酰化的现象。而多元醇头基团的结构和培养基中所用糖的种类无关，主要与菌种[13]和培养基中多元醇种类相关[14]。

Liamocins具有多种商业应用价值，它是比水密度大的油，所以之前一直被称为重油，颜色多为浅黄、深绿、深棕色；表面张力介于27～31.5 mN/m[8]，可作为商业用表面活性剂使用。多篇报道显示，liamocins对某些癌细胞具有抗增殖作用[15-16];具有较强的选择性抗菌能力，对链球菌属有特异性，为出芽短梗霉的一个普遍特性[17];此外，即使受到加热影响仍能保持抗菌活性[13]。

Liamocins的完全合成途径至今尚不清楚。在同位素标记的[U-13C]葡萄糖上培养AureobasidiumpullulansNRRL 50380，使用MALDI-TOFMS分析liamocins,在甘露醇部分发现了13C标记，但是在3,5-二羟基癸酸部分并没有发现[12]。这一信息表明，liamocins的生物合成是相当复杂的。TANG等[18]通过在A.melanogenum9-1中过表达高产聚苹果酸菌株Aureobasidiumsp. P6的PYC1基因，通过提高柠檬酸的产量来提高liamocins的产量，并推测柠檬酸和乙酰-CoA为liamocins的重要前体物质。值得注意的是，在过表达PYC1的同时，ACL和ME基因的转录水平都有不同程度的提高。

本实验以出芽短梗霉P30为研究对象，通过代谢工程改造出芽短梗霉，过表达乙酰-CoA合酶、ATP-依赖性柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和丙酮酸羧化酶基因，使胞质乙酰-CoA含量提高，从而来达到高产liamocins的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物

AureobasidiumpullulansP30(后文简称P30)由本实验室保藏于-80 ℃冰箱，质粒pUC-AHPT和pUC-GB由本实验室构建保藏，实验所用引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 培养基

YEPD培养基(g/L)：酵母浸粉10.0，葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，固体YEPD培养基加入2.0 g/L的琼脂粉。HCS培养基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母浸粉3.0，牛肉膏1.0，蛋白胨10.0，麦芽浸粉3.0，HCl调至pH 5.7，固体HCS培养基加入2.0 g/L琼脂粉。HCS双层培养基：上层为固体HCS培养基，下层固体HCS培养基添加潮霉素B溶液，使终质量浓度为150.0 mg/L。种子培养基(g/L)：木糖20.0，酵母浸粉1.0，K2HPO44.0，(NH4)2SO40.8，MgSO40.2，NaCl 4.0，用HCl调pH至6.0。发酵培养基(g/L)：木糖50.0，酵母浸粉2.0，KNO30.8，NaCl 2.0，K2HPO45.0，MgSO40.3，用HCl调pH至5.5。

1.1.3 酶和试剂

DNA marker、TaqDNA聚合酶、dNTP、Primer Star GXL聚合酶、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒,TaKaRa中国大连公司；胶回收试剂盒、片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒,OMEGE公司；潮霉素B,上海索宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电穿孔仪，美国BTX公司；凝胶成像仪，美国SYN gENE公司；分光光度计，天津普瑞斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 重组菌株的构建

重组菌株的构建采用GUO等[19]的同源重组依赖性DNA装配方法。因普鲁兰糖和liamocins均含有大量碳元素，可能存在碳流竞争的关系，所以以编码普鲁兰糖合成酶基因(PUL1)为整合位点，使碳流更多地流向liamocins的合成。因此，在PUL1位点整合过表达ACS1、ACL、ME、PYC1基因。

1.3.2 培养方法

菌株活化：从甘油管中取10 μL菌液接入装有5 mL YEPD试管中，28 ℃，200 r/min，培养24 h。

种子培养：从活化的菌液中，取1 mL菌液接入到50 mL/250 mL锥形瓶种子培养基中，28 ℃，200 r/min，培养24 h。

发酵培养：将培养好的种子液3 mL接入到50 mL/250 mL锥形瓶发酵培养基中，28 ℃，240 r/min，培养7 d。

1.3.3 重组菌株生长性能测定

从甘油管中取10 μL P30接种于YEPD液体培养基进行活化，于28 ℃，200 r/min的摇床中培养24 h。取已灭菌的装液量为50 mL YEPD液体培养基的250 mL三角瓶，加入50 μL活化的菌液，于28 ℃，200 r/min的摇床中培养。每隔4 h取0.5 mL菌悬液，在12 000 r/min的转速下离心1 min，弃上清液，再用蒸馏水洗涤2次菌体，最后加入2 mL蒸馏水混匀。以蒸馏水为对照，用紫外分光光度计测定OD600值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出生长曲线。

1.3.4 发酵产物的分析方法

生物量、木糖和胞外普鲁兰糖的测定：根据杨金龙等[20]的方法进行测定。发酵液中liamocins含量测定：根据GUO[19]的方法测定。

1.3.5 mRNA水平的测定

本实验中所有P30总RNA的提取和反转录所用的试剂盒均由TaKaRa公司提供，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。mRNA的水平采用Bio-Rad QX200微滴式数字PCR系统的染料法进行测定。

2 结果和分析

2.1 重组菌株的构建

将上同源臂、下同源臂、潮霉素B抗性、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP)终止子和目的基因按照1.3.1方法，转入P30中，得到疑似转化子，并进行PCR验证，得到对应重组菌株。PCR验证结果如图1所示。M泳道为DNA marker，1和3泳道为阴性对照，2，4泳道为以重组菌株基因组为模板所得验证片段，片段大小均符合预期。说明分别过表达ACS1，ACL，ME，PYC1所得到的重组菌株PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1构建成功。对构建成功的过表达菌株进行保藏以便后续研究。

M-DNA marker；1，3泳道-阴性对照；2，4泳道-以重组菌株基因组为模板所得验证片段图1 过表达ACS1、ACL、ME、PYC1菌株PCR验证结果Fig.1 The PCR results of strain overexpression geneACS1, ACL, ME and PYC1

2.2 生长性能测定

将4株改造菌与出发菌株P30分别按照1.3.3方法进行培养，测定生长曲线，如图2所示。4株重组菌生长趋势与出发菌基本一致，说明过表达ACS1、ACL、ME和PYC1基因对菌株的生长性能无明显影响。

图2 重组菌株生长曲线Fig.2 Growth curve of recombinant strains

2.3 木糖利用能力测定

在发酵培养基中对重组菌株和出发菌株发酵，每24 h测定发酵液中木糖剩余量和生物量，如图3所示。图3-a中重组菌株木糖消耗曲线同出发菌株P30基本一致，发酵7 d后发酵液中无木糖残留，说明重组菌的木糖利用能力没有受影响。图3-b中重组菌株总体增长趋势与出发菌株P30较为一致，但在发酵培养基中培养结束后，PEACL的生物量比出发菌低了19.83%，而在测定生长曲线时，显示PEACL的生长未受到影响。或许是因为大量的底物转化为乙酰-CoA从而增强了liamocins合成的同时，导致菌体生长所需营养供应减弱。

a-木糖;b-菌体干重图3 重组菌株的木糖利用能力Fig.3 Xylose utilization ability of recombinant strains

2.4 重组菌株发酵性能的探究

将重组菌株与原始菌株P30在发酵培养基中发酵，待发酵结束后测定菌体干重、普鲁兰糖和liamocins产量，如图4所示。

a-干重;b-普鲁兰糖;c-liamocins图4 重组菌株发酵性能Fig.4 Fermentation performance of recombinant strains

重组菌株的普鲁兰糖产量均低于P30，PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1的普鲁兰糖产量分别降低了12.29%、11.90%、9.37%、13.37%。liamocins的产量较出发株均有所提升，PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1的产量分别比P30高了8.19%、93.74%、13.49%、17.12%。普鲁兰糖的产量略有降低，可能因为一部分碳代谢流向了liamocins的合成。PYC1催化丙酮酸到草酰乙酸的转化，然后在苹果酸脱氢酶的催化下将产生的草酰乙酸还原为苹果酸。当一分子苹果酸通过线粒体柠檬酸转运蛋白(citrate transporter, CTP)进入线粒体，同时一分子柠檬酸通过CTP转移到细胞质中。线粒体中的苹果酸被转化为草酰乙酸，其通过三羧酸循环进一步与乙酰-CoA缩合，产生柠檬酸。细胞质中的柠檬酸在ACL的催化下，随后转化为乙酰-CoA和草酰乙酸。TANG等[18]在高产liamocins菌株A.melanogenum9-1中异源表达高产聚苹果酸菌株Aureobasidiumsp. P6的PYC1基因，能明显提高liamocins产量，但本实验过表达P30的PYC1后，liamocins产量没有达到预期效果，还需要进一步研究,找出原因。产油酵母可以积累超过其生物量20%的油脂[21]，而其中关键酶为ACL，可催化柠檬酸转化为乙酰-CoA和草酰乙酸，前者为脂肪酸和liamocins合成的重要前体。本研究也说明过表达ACL可以大幅度提升liamocins的合成。在过表达ACL后，虽然liamocins的产量提升非常明显，但是生物量和普鲁兰糖的量却有了较为明显的降低，或许是由于该基因的过表达，扰动了菌体本身的代谢流，使底物更多流向liamocins合成。ME的过表达并没有使liamocins的产量明显提升，或许是因为大量的苹果酸转化为丙酮酸，柠檬酸和苹果酸线粒体穿梭中的苹果酸供应不足，从线粒体内转运到细胞质中的乙酰-CoA合成的前体物质柠檬酸减少。ACS可催化乙酸生成乙酰-CoA，而本实验过表达ACS1后liamocins产量提升幅度并不是很大，或许是因为出芽短梗霉中ACS并不是合成乙酰-CoA的关键酶。周丹凤[22]采用菌株ZUST-GS，利用75.17 g/L的木糖发酵，得到8.41 g/L的liamocins，转化率为0.11 g/g。LEATHERS等[23]使用菌株A.pullulansNRRL 50384利用120 g/L的蔗糖发酵，得到22 g/L的liamocins，转化率为0.18 g/g。TANG等[18]使用菌株A.melanogenumM39,利用140 g/L的葡萄糖发酵，得到35.3 g/L的liamocins，转化率为0.25 g/g。以上分别为出芽短梗霉以木糖、蔗糖、葡萄糖为主要碳源发酵产liamocins的最大产量及liamocins转化率。PEACL利用50 g/L木糖发酵，得到19.44 g/L的liamocins，转化率为0.38 g/g。虽然NRRL 50384和M39的liamocins产量高于PEACL，但转化率均较低，PEACL的liamocins的产量和转化率均优于ZUST-GS。

2.5 过表达基因转录水平测定

分别提取出发菌株和重组菌株的RNA，并选取3-磷酸-甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作为内参进行微滴式数字PCR反应。分别对每株重组菌株对应基因的转录水平进行定量分析，如图5所示。重组菌株的相应基因的转录水平都有所升高，进一步验证了所有过表达菌株均构建成功，但结果显示，各个基因的转录水平提高程度不尽相同。过表达ACS1、ACL、ME、PYC1基因菌株的转录水平分别提高了8.16、0.94、14.78和12.17倍。值得注意的是，虽然PEACL对应基因的转录水平提高较低，但从发酵结果来看，其liamocins产量的提升幅度非常高，远大于过表达其他基因的菌株，这表明出发株P30的liamocins合成或许受到ACL的转录水平限制，而ACL为P30合成liamocins的关键酶。

图5 重组菌株对应基因相对转录水平Fig.5 Relative transcription level of the corresponding gene of the recombinant strain

3 结论

本研究分别过表达乙酰-CoA合成相关基因ACS1、ACL、ME、PYC1，成功构建了重组菌株PEACS1、PEACL、PEME和PEPYC1。结果发现，重组菌株的liamocins产量都有不同程度的提高，效果最明显的是过表达ACL，虽然该基因过表达后其转录水平提升幅度不大，但liamocins产量提高了93.74%，这说明过表达该基因能明显地促进liamocins合成，并且该基因为P30合成liamocins的关键基因，其合成liamocins的能力或许受ACL转录水平的限制。以上结果说明，强化乙酰-CoA合成可以提高liamocins产量，而其中的ACL基因对出芽短梗霉liamocins的合成至关重要。