四君子汤中总多糖、总黄酮和总皂苷的纯化工艺研究

2020-06-06王伊楠张莉丹董征艳郭宇航王鹏飞段秀俊

山西中医药大学学报 2020年2期

刘培，王伊楠，张莉丹，董征艳，王科，郭宇航，王鹏飞，段秀俊

（山西中医药大学，山西晋中030619）

四君子汤又名白术汤，源于宋代《太平惠民和剂局方》［1］，其组成包括人参、白术、茯苓、甘草四味中药，临床上常用党参代替人参。党参性甘，为君药，具有补脾养胃、生津益气之效；白术甘苦性温，为臣药，可助君药燥湿健脾、益气助运；茯苓甘淡性平，为佐药，具有渗湿健脾的功效；甘草甘淡，为使药，可用于调和诸药，和中益气［2］。四药相辅相成，具有益气补中、健脾养胃的作用，能够调节胃肠道功能、促进消化吸收、增强机体免疫力、抗衰老及促进癌细胞凋亡，现临床多用于治疗慢性胃炎、胃溃疡、功能性消化不良、慢性腹泻、溃疡性结肠炎等胃肠道疾病。四君子汤水煎液中主要含有黄酮类、皂苷类、多糖等成分，还包括一些生物碱类和挥发油［3-6］，这些有效成分相辅相成，共同作用。有文献报道四君子汤中的多糖类、黄酮类、皂苷类为其有效成分，但并没有关于四君子汤中总多糖、总黄酮和总皂苷成分提取纯化的研究报道。因此，本文对回流水提取的四君子汤进一步纯化，采用单因素与正交试验相结合的方法，优选总多糖、总黄酮及总皂苷的最佳纯化工艺，为四君子汤的进一步研究提供理论基础。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

党参为桔梗科植物党参的干燥根（批号：180102），白术为菊科植物白术的干燥根茎（批号：180101），茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核（批号：180302），均购自山西维康堂中药饮片有限公司；甘草为豆科植物甘草的干燥根和根状茎（批号：141147），购自河北亚宝药业有限公司，由山西中医药大学段秀俊副教授鉴定为正品；D-葡萄糖标准品（批号：110833-201205），芦丁标准品（批号：100080-200707），苷草酸标准品（批号：181006），购于中国食品药品检定研究院；无水乙醇、苯酚、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氨水、正丁醇、香草醛、乙酸、高氯酸等试剂均为分析纯，水为哇哈哈纯净水。

1.2 实验仪器

UV-6100S 紫外-可见分光光度计（上海元析仪器责任有限公司），AUW120D 电子天平（岛津），SK-101 数显鼓风干燥箱（上海圣科仪器设备有限公司），SHB-Ⅲ循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），SY-2000 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），KQ5200V 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-2 数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），ZNHW-II 智能恒温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 四君子汤中总多糖的纯化工艺优选

2.1.1 四君子汤中总多糖含量测定方法的建立

2.1.1.1 四君子汤饮片干浸膏的制备称取干燥的党参9 g，茯苓9 g，白术9 g，甘草6 g，加10 倍量的水100 ℃水浴回流1 h，过滤，滤渣加8 倍量水100 ℃水浴回流45 min，合并2 次滤液，减压浓缩，待冷却后加入乙醇使药液含醇量为75%，于4 ℃的冰箱中静置，取出滤过，滤液回收乙醇，滤渣加水溶解，于70 ℃烘干。

2.1.1.2 对照品溶液的制备精密称取D-葡萄糖标准品15.26 mg，至10 mL 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得浓度为1.5260 mg/mL 的D-葡萄糖标准品母溶液。再取D-葡萄糖标准品母溶液1 mL 稀释至5 mL，得0.305 2 mg/mL 的D-葡萄糖标准品溶液。

2.1.1.3 供试品溶液的制备取按“2.1.1.1”项下制备的四君子汤饮片干浸膏0.1 g，精密称定，置100 mL 圆底瓶中，加水50 mL，100 ℃回流60 min，放至室温，加水补足减失的质量，滤过，精密移取20 mL 于50 mL 圆底烧瓶中，减压浓缩后，置于10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，再取1 mL加水稀释至5 mL，即得。

2.1.1.4 苯酚-浓硫酸比色法测定四君子汤中总多糖含量精密吸取供试品溶液0.8 mL 于具塞试管，加水至1 mL，加入5%苯酚1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，置冷水浴中降至室温后，置沸水浴加热15 min，再置于冷水浴中降至室温，随行作空白对照，于490 nm 测吸光度［7］。

2.1.2 四君子汤中总多糖纯化工艺的单因素考察

2.1.2.1 醇沉浓度对总多糖提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，恒定浓缩至药液比为1∶1，待冷却后分别加入乙醇使药液含醇量为65%、70%、75%、80%、85%，于冰箱中静置12 h，按“2.1.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1.4”项下方法显色并测定总多糖含量，结果总多糖提取含量分别为93.343 7 mg/g、91.227 9 mg/g、85.223 3 mg/g、98.693 4 mg/g、98.773 8 mg/g。结果表明，随着醇浓度的变化，多糖含量在醇浓度为80%达到最高峰，所以实验选择醇浓度为80%。

2.1.2.2 浓缩密度对总多糖提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，分别浓缩至药液比为1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，加入乙醇使药液含醇量为75%，于冰箱中静置12 h，按“2.1.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1.4”项下方法显色并测定总多糖含量，得到的总多糖提取量分别为92.061 8 mg/g、93.721 1 mg/g、89.841 3 mg/g、90.004 2 mg/g、83.401 8 mg/g，结果表明多糖含量在浓缩密度为1∶1.25 时达到最高峰，所以实验选择浓缩密度为1∶1.25。

2.1.2.3 静置时间对总多糖提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，分别浓缩至药液比为1∶1，加入乙醇使药液含醇量为75%，于冰箱中分别静置1、3、6、12、18 h，按“2.1.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1.4”项下方法显色并测定总多糖含量，得到总多糖提取量为80.089 8 mg/g、75.844 2 mg/g、80.480 9 mg/g、87.866 2 mg/g、83.340 8 mg/g。结果表明，随着静置时间的变化，多糖含量在静置时间12 h 时达到最高峰，所以实验选择静置时间12 h。

2.1.2.4 正交试验考察依据单因素试验结果，确定三因素三水平：乙醇浓度A（75%、80%、85%），浓缩密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1.00），静置时间D（6 h、12 h、18 h）［8-10］。采用L9（34）正交表考察最佳纯化工艺。正交试验结果见表1，方差分析见表2。

表1 四君子汤中总多糖纯化工艺正交试验结果

表2 四君子汤中总多糖纯化工艺方差分析

表3 验证试验结果（mg/g）

由表1～2 可知，各因素对总多糖醇沉的影响顺序为：醇浓度＞浓缩密度＞静置时间。实际试验最佳组合为A3B2D3，统计学最佳组合为A3B2D1，将此两种方案做了3 次重复试验，结果见表3。试验结果无明显差异，再加上D 为不显著因素，从节时的角度确定A3B2D1为最佳组合，即醇浓度为85%，浓缩密度1∶1.25，静置时间6 h。

2.2 四君子汤中总黄酮的纯化工艺研究

2.2.1 四君子汤中总黄酮含量测定方法的建立

2.2.1.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5.45 mg，置5 mL 容量瓶中，加入适量的70%乙醇充分溶解后，定容至刻度，摇匀，得1.09 mg/mL 的芦丁对照品溶液［11］。

2.2.1.2 供试品溶液的制备取按“2.1.1.1”项下制备的四君子汤干浸膏0.2 g，精密称定，用70%乙醇20 mL 超声提取30 min，过滤，挥干溶剂，残渣加70%乙醇定容至10 mL，即得［12-13］。

2.2.1.3 亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定四君子汤中总黄酮的显色方法精密量取“2.2.1.2”项下供试品溶液1 mL 至25 mL 容量瓶中，加水5 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，6 min 后加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，6 min 后加入10%的NaOH 溶液5 mL，蒸馏水定容，随行做空白对照，10 min 后于510 nm 测定吸光度［12，14-15］。

2.2.2 四君子汤中总黄酮纯化工艺的单因素考察

2.2.2.1 醇浓度对总黄酮提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，浓缩至药液比为1∶1，加入乙醇使药液含醇量分别为65%、70%、75%、80%、85%，静置12 h，按“2.2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.1.3”项下方法显色并测定总黄酮含量，计算总黄酮提取量，结果分别为15.092 mg/g、15.921 mg/g、15.518 mg/g、16.983 mg/g、16.347 mg/g。结果表明，含醇浓度为80%时，药材中总黄酮的含量达到峰值，故试验选择药液含醇量为80%。

2.2.2.2 浓缩密度对总黄酮提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，分别浓缩至药液比为1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，加入乙醇使药液含醇量为75%，静置12 h，按“2.2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.1.3”项下方法显色并测定总黄酮含量，结果得到总黄酮提取量分别为20.526 mg/g、22.963 mg/g、20.169 mg/g、16.580 mg/g、14.947 mg/g。结果表明，总黄酮收率在浓缩密度为1∶1.25 时达到峰值，故试验选择浓缩密度为1.25 倍。

2.2.2.3 静置时间对总黄酮提取量的影响按“2.2.1.1”项下处理样品，浓缩至药液比为1∶1，加入乙醇使药液含醇量为75%，于常温分别静置1 h、3 h、6 h、12 h、18 h，按“2.2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.1.3”项下方法显色并测定总黄酮含量，计算总黄酮提取量，结果分别为20.361 mg/g、22.413 mg/g、19.623 mg/g、20.509 mg/g、16.614 mg/g。结果表明，总黄酮收率在静置时间为3 h 时达到峰值，故试验选择静置时间为3 h。

2.2.3 正交试验考察依据单因素实验结果，确定三因素三水平：醇浓度A（75%、80%、85%），浓缩密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1），静置时间D（1 h、3 h、6 h）。采用L9（34）正交表考察最佳纯化工艺。正交试验结果见表4，方差分析见表5。

表4 四君子汤中总黄酮纯化工艺正交试验结果

表5 四君子汤中总黄酮纯化工艺方差分析

表6 验证试验结果（mg/g）

由表4～5 可知，各因素对总黄酮提取率的影响顺序为：浓缩密度＞静置时间＞醇浓度。由表4可知：实际试验结果可知最佳纯化工艺为A1B3D3，统计学最佳组合为A1B2D3，将此两种方案做了重复试验3 次，试验结果见表6。试验结果总黄酮含量无明显差异，从节省能源、节约资源的角度考虑，最终选择最佳提取纯化工艺为A1B3D3，即用75%乙醇、浓缩至1∶1、静置6 h。

2.3 四君子汤中总皂苷的纯化工艺研究

2.3.1 四君子汤中总皂苷含量测定方法的建立

2.3.1.1 对照品溶液的制备精密称取甘草酸对照品12.01 mg，置2 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容至刻度，摇匀，得6 mg/mL 的甘草酸对照品母溶液。再取甘草酸对照品母溶液1 mL 稀释至10 mL，得0.6 mg/mL 的甘草酸对照品溶液。

2.3.1.2 供试品溶液的制备精密称定“2.1.1.1”项下四君子汤饮片干浸膏0.1 g，用20 mL 蒸馏水超声提取20 min，加20 mL 乙醚进行脱脂2 次，取水层置分液漏斗中用水饱和的正丁醇50 mL进行萃取，共4 次，收集正丁醇液，加2 倍5%氨水试液洗涤2 次，再用水饱和的正丁醇溶液洗涤3 次，每次100 mL。挥干正丁醇并用甲醇定容至5 mL 容量瓶中，过滤，从续滤液中移取1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀后，即得［14］。

2.3.1.3 1%香草醛乙酸-高氯酸比色法测定四君子汤中总皂苷的含量精密量取供试品溶液1 mL于10 mL 具塞刻度试管中，水浴挥干甲醇，冷却后准确加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液（2∶8）0.5 mL，立即摇匀，60 ℃恒温水浴上充分混匀后加热15 min，取出，立即冰浴冷却后，准确加入77%的硫酸溶液5 mL，摇匀。随行做空白对照，于43 7nm 测吸光度［15-16］。

2.3.2 四君子汤中总皂苷纯化工艺的单因素考察

2.3.2.1 醇浓度对总皂苷提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，浓缩至药液比为1∶1，加入乙醇使药液含醇量为65%、70%、75%、80%、85%，于冰箱中静置12 h，按“2.3.1.2”制备供试品溶液，按“2.3.1.3”项下方法显色并测定总皂苷含量，得到总皂苷提取量依次为8.242 mg/g、8.389 mg/g、9.163 mg/g、9.495 mg/g、9.277 mg/g。结果表明，药液含醇量为80%时，总皂苷含量达到峰值，故选择醇浓度为80%。

2.3.2.2 浓缩密度对总皂苷提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，分别浓缩至药液比为1∶1.5、1∶1.25、1∶1、1∶0.75、1∶0.5，乙醇使药液含醇量为75%，于冰箱中静置12 h，按“2.3.1.2”制备供试品溶液，按“2.3.1.3”项下方法显色并测定总皂苷含量，计算总皂苷提取量依次为9.274 mg/g、10.596 mg/g、9.207 mg/g、7.570 mg/g、6.884 mg/g。结果表明，浓缩密度为1∶1.25 时，总皂苷含量达到峰值，故试验选择浓缩密度为1.25 倍。

2.3.2.3 静置时间对总皂苷提取量的影响按“2.1.1.1”项下处理样品，浓缩至药液比为1∶1，乙醇使药液含醇量为75%，于冰箱中分别静置1、3、6、12、18 h，按“2.3.1.2”制备供试品溶液，按“2.3.1.3”项下方法显色并测定总皂苷含量，计算总皂苷提取量依次为9.479 mg/g、10.068 mg/g、9.199 mg/g、9.309 mg/g、7.586 mg/g。结果表明，当静置时间为3 h 的时候总皂苷的含量最大，故试验选择静置时间为3 h。

2.3.3 正交试验考察依据单因素试验结果，确定三因素三水平：醇浓度A（75%、80%、85%）、浓缩密度B（1∶1.5、1∶1.25、1∶1）和静置时间D（1 h、3 h、6 h），采用L9（34）正交表考察最佳提取工艺。正交试验结果见表7，方差分析见表8。

由表7～8 可知，A、B、C、D 均为不显著因素（P＞0.05）。影响四君子汤中总皂苷含量的因素顺序为浓缩密度＞醇浓度＞静置时间。实际试验最佳组合为A3B3C2D1，统计学最佳组合为A3B3D3，将此两种方案做了重复试验3 次，结果见表9。试验确定A3B3D3为最佳组合，即醇浓度为85%，浓缩密度1∶1，静置时间6 h。