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右美托咪定预处理对脓毒症相关性脑病大鼠中枢及外周炎性反应的保护作用

2020-06-06张春芳邹平洋陆晓勤刘先保广州医科大学附属第三医院妇产科广州5050广州医科大学附属第三医院麻醉科九江市第一人民医院麻醉科通讯作者mail4576589qqcom

山西医科大学学报 2020年5期
关键词:脑病咪定脓毒症

张春芳,邹平洋,苏 娜,陆晓勤,刘先保(广州医科大学附属第三医院妇产科,广州 5050;广州医科大学附属第三医院麻醉科;九江市第一人民医院麻醉科;通讯作者,E-mail:4576589@qq.com)

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性α2肾上腺能受体激动剂,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用。近几年在临床麻醉中应用非常广泛,发现可以减少术后认知功能障碍[1],动物实验通过右美托咪定减轻海马炎症防治老年大鼠术后认知功能障碍[2]。右美托咪定可能通过作用外周和中枢神经系统交感神经,减少细胞因子和趋化因子释放作用[3,4]。近年研究发现[5-8],右美托咪定还具有脑、心脏、肺和肾等多种重要器官保护作用,并且能发挥明显的全身抗炎效应。Chu等[9]在研究辣椒素对脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症分子的影响中发现NF-κB/IκB参与调节LPS诱导巨噬细胞炎症因子释放,可以调节COX-2,iNOS,IκB-α, VR-1表达。而Zhai等[10]发现右美托咪定通过HMGB1/TLR4/NF-κB传导通路对脑缺血再灌注大鼠脑损伤产生神经保护作用。LPS诱导炎症释放过程中,右美托咪定是否通过NF-κB/IκB传导通路调节炎症释放产生神经保护作用?基于此,本研究根据文献[11]选择脂多糖制备脓毒症相关性脑病大鼠模型,观察右美托咪定对脓毒症大鼠外周及中枢炎性反应的保护作用,探索右美托咪定在脓毒症相关性脑病大鼠的神经保护作用机制,为脓毒症相关性脑病患者临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及分组

右美托咪定(批号:H20090248,江苏恒瑞医药股份有限公司)、LPS(批号:L2880美国Sigma公司)、IκB、NF-κB、TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2(批号ab32518,ab16502,ab6671,ab9722, ab15323, ab15191,Abcma公司),TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10(批号:CSB-E11987r,CSB-E08055r,CSB-E04640r,CSB-E04595r,华美公司)。实验分4组:对照组(NC组)、LPS组、DEX干预组和DMSO组。40只雌性SD大鼠,按随机数字法分组,每组10只。NC组腹腔注射生理盐水1 ml,LPS组腹腔注射LPS(10 mg/kg,稀释到1 ml);DEX组在给LPS前30 min注射右美托咪定(100 μg/kg)提前干预;DMSO组腹腔注射2%DMSO 1 ml。

1.2 模型建立[11]

健康雌性SPF级SD大鼠,10周龄,体质量220-250 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号SCXK(粤)2013-0002,实验动物质量合格证440072000028425)。饲养于18-25 ℃环境中,自由饮食、摄水,饲养1周适应环境进行造模。固定大鼠,腹腔单次注射LPS(10 mg/kg,稀释到1 ml),放入笼中观察大鼠行为学变化,出现稀便,尿液颜色及气味改变,呼吸频率变快,幅度减小等表现,抽外周血检测血清S100β升高,即认为LPS致大鼠脓毒症相关性脑病模型建立成功[12]。腹腔注射LPS造模后6 h采用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后快速取新鲜血浆和大脑海马组织,血浆行ELISA检测,海马组织行Western blot和RT-qPCR检测。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10 具体步骤:①包被:用0.01 mol/L的包被液将检测抗体稀释至浓度为1-10 μg/ml。96孔板中每孔加0.1 ml,在4 ℃过夜孵育。次日吸去加样孔的孵育液体。②加样:37 ℃孵1 h洗涤。③加酶标抗体:加入新鲜稀释的酶标抗体0.1 ml于加样孔中。37 ℃孵育0.5-1 h,洗涤。④加底物液显色:将0.1 ml新鲜配制的TMB 底物溶液加入加样孔,37 ℃孵育10-30 min。⑤终止反应:将2 mol/L的0.05 ml硫酸加入加样孔中。⑥OD值测定。

1.3.2 Western blot蛋白印迹检测NF-κB、IκB、iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1 具体步骤:①海马组织蛋白提取:称组织放入匀浆器;加入300 μl预冷蛋白裂解液,冰上操作,匀浆器匀浆大约30下;移出匀浆液1.5 ml到EP管,10 000 r/min 4 ℃离心5 min;取少量上清液BCA方法检测蛋白浓度,取上清液至新的EP管;加入5×loading buffer,煮沸样品,-20 ℃保存备用。②安装SDS-PAGE电泳胶板模型,配置分离胶溶液,制备浓缩胶,将凝胶模板放入电泳槽上固定好,依次上样。开始时电压设置100 V,待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后,将电压设置130 V,完成后断开电源。③转膜,抗体孵育,曝光显影。

1.3.3 RT-qPCR基因检测NF-κB mRNA 具体步骤:RNA逆转录步骤、冰上配制反应体系、混匀反应体系,37 ℃反应1 h、反应完后放冰上备用。反应条件:使用ViiA7 software 95 ℃ 30 s;95 ℃ 3 s,60 ℃ 34 s(收集荧光信号);45个循环。融解曲线分析:温度60-95 ℃,每分钟读1次。引物设计:NF-κB引物 F:CAACGGGTAAACTTGTCCCT,R:TTGAACAGCTGGCATAGTCC;GAPDH序列F:ACTAACCCTGCGCTCCTG,R:CCCAATACGACCAAATCAGA。

1.4 统计学方法

应用SPSS19.0软件进行统计学分析,计量资料运用均数±标准差进行统计描述,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA法检测结果

与NC组比较,DMSO组各指标差异无统计学意义(P>0.05),LPS组和DEX组外周血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表达差异有统计学意义(P<0.05)。与DMSO组比较,LPS组和DEX组TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表达差异有统计学意义;与LPS组比较,DEX组TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10表达差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.2 Western blot蛋白印迹检测结果

与NC组比较,DMSO组各指标差异无统计学意义(P>0.05),LPS组和DEX组海马组织TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表达差异有统计学意义(P<0.05)。与DMSO组比较, LPS组和DEX组TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表达差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,DEX组TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及IκB表达差异有统计学意义(P<0.05,见表2,图1)。

与NC组比较,*P<0.05; 与DMSO组比较,#P<0.05;与LPS组比,&P<0.05

表2 Western blot检测海马组织IκB、TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2表达 (n=10)Table 2 Expression of IκB,TNF-α,IL-1,iNOS, and COX-2 in hippocampus using Western blot (n=10)

与NC组比较,*P<0.05;与DMSO组比较,#P<0.05;与LPS组比,&P<0.05

图1 海马组织IκB、TNF-α、IL-1、iNOS和COX-2 的蛋白表达Figure 1 The expression of IκB,TNF-α,IL-1,iNOS and COX-2 in hippocampus by Western blot

2.3 RT-qPCR基因检测结果

与NC组比较,DMSO组NF-κB mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),LPS组和DEX组NF-κB mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,DEX组NF-κB mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 RT-qPCR检测海马组织NF-κB mRNA表达(n=10)Table 3 Expression of NF-κB mRNA in hippocampus using RT-qPCR (n=10)

与NC组比较,*P<0.05;与DMSO组比较,#P<0.05,与LPS组比,&P<0.05

3 讨论

脓毒症相关性脑病(SAE)是指缺乏临床或实验室证据的中枢神经系统感染, 由全身炎性反应引起的弥散性脑功能障碍,是全身炎症反应所致的弥漫性大脑功能障碍和意识改变,主要病理生理为神经元细胞变性坏死,同时伴有白细胞浸润、星型胶质细胞和小胶质细胞激活,级联产生及多种炎性因子、自由基。因此,LPS介导的脓毒性脑病是多种炎症细胞和多种细胞因子参与的机体全身炎症反应综合征与代偿性抗炎反应综合征之间平衡失调而诱发的中枢炎性疾病。

本研究通过腹腔注射LPS建立脓毒症脑病动物模型,观察全身炎症水平和海马组织炎症因子基因表达及其含量,可见外周血促炎因子(TNF-α、NO、IL-1、IL-6)和抗炎因子(IL-10)水平变化。具体研究结果显示,与NC组比较,LPS组外周血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10表达显著上升。与LPS组比较,DEX组TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10表达显著下降。有研究发现[13],DEX通过降低M1标记基因如TNF-α,IL-1β和IL-6的表达而发挥强效抗炎作用。重要的是,DEX改善了小胶质细胞M2标记物精氨酸酶-1(Arg-1),抵抗素样分子(Fizz-1)和CD206的表达,还增强了Akt通路的激活。在中等剂量和高剂量下用DEX预处理导致IL-1,IL-6,TNF-α和PGE2表达的明显下调,以及IL-2水平的上调。文献资料结果与本研究结果基本一致,也弥补了本研究只选用一个高剂量的缺陷(100 μg/kg)。腹腔注射DEX对脓毒症脑病动物模型外周炎症有明显改善作用,右美托咪定可以调节脓毒症脑病大鼠外周血TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10的表达。我们的研究结果提示,右美托咪定预处理可改善脓毒症脑病大鼠外周炎性因子释放。也有很多研究者发现右美托咪定这种抑制炎症因子的释放,起到了保护器官功能的作用,同时也发现右美托咪定抑制炎症因子的释放可能有多种机制参与,调节炎症因子释放可能涉及到自噬、MAPK、TRL-4/NF-κB等传导通路[14,15],NF-κB在调节炎症释放中可能起到重要作用。

本研究进一步探索右美托咪定在LPS诱导脓毒症相关性脑病大鼠中抑制炎症释放的作用机制,观察到海马组织中TNF-α、IL-1、iNOS、COX-2及NF-κB mRNA表达显著上升,IκB表达显著下降,TNF-α、IL-1、iNOS表达与外周血中表达呈正相关性。右美托咪定干预后,TNF-α、IL-1、iNOS下调,与外周血清相关指标变化一致,提示外周与中枢存在某种关联。本研究还发现LPS组海马组织NF-κB mRNA表达显著下降,IκB表达显著上升,右美托咪定干预后可以调节其表达水平。所以NF-κB、IκB与外周血促炎因子和抗炎因子释放有着密切的关系。这一点也有研究证实[16],暴露LPS大鼠有显著的认知功能障碍,用LPS处理的大鼠血清和海马匀浆中TNF-α和IL-6的水平明显增加。DEX预处理可以减少LPS暴露导致TNF-α,IL-6和NF-κB表达。LPS暴露,NF-κB阻断剂PDTC预处理抑制了促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)的产生。DEX联合PDTC应用比单纯LPS暴露治疗的TNF-α和IL-6表达更低。PDTC和DEX联合应用效果更佳明显。 Zhang等[17]研究结果表明,在LPS诱导的认知功能障碍模型中,DEX通过NF-κB发挥神经保护作用。我们的结果也显示,LPS暴露脓毒症相关性脑病大鼠海马组织中,右美托咪定干预后可以导致NF-κB mRNA表达显著下降,IκB表达显著上升。根据我们研究结果及近期研究文献显示,右美托咪定能够抑制外周及中枢炎症因子的释放,可能是通过NF-κB/IκB信号通路来调节外周及中枢炎症而发挥作用,从而发挥了神经保护作用。

本研究也存在一些不足之处,所以获得的结果也存在一定局限性,比如本研究未选取多个时间点采集标本动态检测外周及中枢相关的指标,未采用不同剂量的右美托咪定对脓毒症相关性脑病大鼠进行干预,未探讨是否存在剂量依赖性。由于经费问题,未采用多种检测方法检测外周及海马组织核心转录因子(NF-κB)、IκB以及炎症因子,下一步将继续深入研究右美托咪定在外周及中枢炎症神经保护作用机制。

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