4种天然温石棉致大鼠肺损伤及对HO-1和HSP-70的影响

2020-06-05陈建国黄柳雯霍婷婷邓建军孙耀川张青碧

岩石矿物学杂志 2020年3期

陈建国，黄柳雯，李杰，崔琰，霍婷婷，邓建军，孙耀川，张青碧

(1.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州 646000;2.泸州市疾病预防控制中心，四川泸州 646000;3.西南医科大学药学院，四川泸州 646000;4.泸州市卫生健康委员会，四川泸州 646000;5.西南科技大学，四川绵阳 621010;6.四川绵阳四〇四医院，四川绵阳 621000;7.西南交通大学地球科学环境工程学院，四川成都 611756)

石棉是性能优异的纤维状硅酸盐矿物质，可分为温石棉和角闪石石棉。随着应用的深入，人类渐渐意识到石棉纤维对人体健康有不良影响，可致肺纤维化、肺癌、胸膜间皮瘤、胸膜斑等(施海燕等，2009)。国际癌症研究组织(IARC)已宣布石棉是一类致癌物质(Andersen et al.，2002)，但温石棉的使用安全性仍然存在较大争议(杨方明，2002)。中国虽已在2002年淘汰了角闪石石棉，却仍是全球温石棉最大消费国和第二大生产商(Courtice et al.，2012;Wang X et al.，2013)，其中甘肃阿克塞、青海茫崖、四川新康、陕西陕南是我国温石棉的主要产地，有超过一百万人职业暴露于温石棉环境下。目前，温石棉导致肺部损伤的机制涉及炎症反应、氧化应激、细胞凋亡及基因突变等方面。血红素氧化合酶1(HO-1)具有抗炎、抗氧化应激、抗气道平滑肌细胞增殖等重要功能(Wagener et al.，2001;Song et al.，2002)，细胞内热休克蛋白70(HSP-70)具有抗凋亡、抗炎作用(Song et al.，2008)。有研究表明颗粒物或较短纤维对肺部的损伤与HO-1和HSP-70有关(Farina et al.，2011;Obata et al.，2011;Sancini et al.，2014;Yoshiura et al.，2015)。本研究以我国甘肃阿克塞、青海茫崖、四川新康、陕西陕南四大矿区的天然温石棉为研究对象，用扫描电子显微镜、红外光谱和X射线荧光光谱分析粉尘形貌、表面活性基团和化学组分，并对Wistar大鼠进行多次非暴露式气管滴注染毒，观察各时间点大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)和总蛋白(TP)含量的变化，以及肺组织中HO-1、HSP-70 mRNA和HO-1、HSP-70蛋白表达量的变化，为探讨温石棉致大鼠肺部损伤及其可能的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要仪器有7200型分光光度计(优尼柯上海仪器公司，FJ7200)、酶标仪(thermo Multiskan Spectrum)、卧式行星球磨机(QM-3SP4J，南京大学仪器厂)、冷冻离心机(eppendorf，5810R)、扫描电子显微镜(Libra 200FE，德国蔡司公司)、红外光谱仪(Spectrum One，美国PE仪器公司)、X射线荧光光谱仪(PW1404，Philips)、DNA/RNA测定仪(Nano-Drop 1000，日本 Olympus公司)和 96孔 PCR仪(ABI7900HT，Life technologies公司)。

主要试剂有乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、总蛋白(TP)检测试剂盒(南京建成生物制品研究所)，Trizol试剂提取盒(北京天根生化科技有限公司)，PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂(Takara公司)，BCA蛋白定量试剂盒(巴傲得生物科技有限公司)，兔抗大鼠 HO-1多克隆抗体(英国 Abcam公司)，兔抗大鼠HSP-70多克隆抗体(美国Cell Signaling Techology公司)，β-actin小鼠单克隆抗体(北京柏奥易杰科技有限公司)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京柏奥易杰科技有限公司)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京柏奥易杰科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备及特性分析

受试物为我国甘肃阿克塞、青海茫崖、四川新康、陕西陕南四大矿区的天然温石棉。将4种矿石用高速粉碎机初步粉碎2～3 min，然后用行星球磨机湿磨阿克塞温石棉30 h、茫崖温石棉18 h、新康温石棉24 h、陕南温石棉30 h，收集矿浆，置于150℃烘箱内烘烤2 h，磨碎备用。采用扫描电子显微镜观察矿物粉尘形貌;红外光谱仪分析研磨后的矿物粉尘表面活性基团，扫谱范围4 000～400 cm-1;X射线荧光光谱仪分析矿物粉尘的主要化学组分和微量元素。

1.2.2 实验动物与分组

选用的初断乳、4～6周龄、体重180～220 g的SPF级Wistar大鼠雄鼠共90只，由西南医科大学实验动物中心提供(经西南医科大学动物伦理审查委员会同意，合格证号201601011)，随机分为5组即阿克塞、茫崖、新康、陕南温石棉组和阴性对照组(生理盐水)，每组18只，分笼喂养，适应性喂养1周。

1.2.3 实验动物染毒与取材

称取0.02 g消毒温石棉粉体，加入生理盐水和青霉素钠(8 000 U/mL)，制备成浓度2.0 mg/mL的温石棉悬液，用前超声处理30 min。采用非暴露式气管滴注法染毒大鼠，每次0.5 mL，每月1次。阴性对照用生理盐水。滴注后自由饮水、进食。分别在滴注1、6、12个月时各取材6只，迅速取出肺组织称量，用EP管分装置 -80℃冰箱保存备用。生理盐水反复灌洗右肺3次后收集灌洗液(回收率80%以上)于离心管中即为支气管肺泡灌洗液(BALF)。

1.2.4 大鼠BALF中LDH、AKP和TP的测定

BALF中LDH、AKP和TP的含量分别采用2，4-二硝基苯肼比色法、分光光度法、考马斯亮蓝法测定，实验步骤按照试剂盒说明书严格操作，观察我国四大矿区天然温石棉对大鼠肺损伤作用。

1.2.5 大鼠肺组织HO-1、HSP-70 mRNA的表达

取肺组织，TRIzol法抽提总RNA，逆转录反应，PCR扩增。实验步骤按照试剂盒说明书严格操作。HO-1、HSP-70和β-actin mRNA引物序列见表1。

表1 HO-1、HSP-70及β-actin mRNA引物序列Table 1 Gene primer sequences of HO-1，HSP-70 and β-actin

1.2.6 大鼠肺组织HO-1、HSP-70蛋白的表达

将肺组织放入研钵中研磨，加入蛋白抽提试剂和蛋白酶抑制剂，提取蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度，于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离后转移至PVDF膜，本实验采用湿转的转膜方式，电流130 mA，电压60 V左右，时间为60 min。小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭 1 h，将 HO-1 一抗(1∶1 000)、HSP-70 一抗(1∶1 000)、β-actin 一抗(1∶5 000)用封闭液稀释，将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，后加入二抗，室温反应1 h，再用TBST洗膜3次。将上述PVDF膜置于ECL显影液中，采集图像，ImageJ软件扫描读取蛋白条带的灰度值并分析，以β-actin为内参计算蛋白相对表达量。

1.2.7 数据分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析。定量资料若服从正态分布，用x±s描述;若方差齐采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计推断，两两比较用SNK-q法检验，否则采用Kruskal-Wallis检验。检验水准α=0.05。

2 测试与结果

2.1 样品形貌

图1 我国四大矿区天然温石棉样品形貌Fig.1 A photo of four natural chrysotile asbestos samples from major mining areas in China

图1分别为阿克塞温石棉原样(A)与湿磨30 h后制备的矿物粉体(a)、茫崖温石棉原样(B)与湿磨18 h后制备的矿物粉体(b)、新康温石棉原样(C)与湿磨24 h后制备的矿物粉体(c)、陕南温石棉原样(D)与湿磨30 h后制备的矿物粉体(d)的自然光下照片。湿磨后的矿物粉体保存备用于后续体内滴注。

2.2 粉体显微形貌分析

扫描电镜图像显示，4种温石棉粉尘的显微形态类似，均为纤维状，并掺杂有少量其他块状矿物。阿克塞温石棉为长纤维，形态较一致;茫崖温石棉为更细长的纤维，并与小而薄的块状结构混合;新康温石棉有团聚现象;陕南温石棉相对较短并且混合了薄块状结构(图2)。

2.3 粉体红外光谱分析

如图3所示，我国四大矿区天然温石棉样品在各自3个研磨时间段后的红外光谱图吸收峰的峰位峰形基本相同。4种温石棉FTIR图谱共同显示，1 622和1 618 cm-1附近的吸收带转移到了更高的波数。3 695～3 650 cm-1附近的吸收谱带是—OH的吸收峰，主要由内外—OH伸缩振动引起;1 050～950 cm-1附近的吸收谱带主要由Si—O伸缩振动引起;650～600 cm-1附近的吸收谱带主要由Mg—O伸缩振动引起。新康温石棉1 630和1 455 cm-1附近的吸收带发生了偏移。因为红外光谱对阳离子的质量和电价敏感，—OH伸缩振动频率受到具有—OH配位的八面体阳离子的影响，导致了在低波数方向上的分裂和移动。阿克塞和陕南温石棉1 060 cm-1附近的Si—O伸缩振动带吸收分裂与新康温石棉相比有差异，表明这两种温石棉的晶体结构比茫崖和新康更完整。通过上述分析，初步确定4种石棉样品是温石棉，且经不同时间研磨后，其结晶度和化学活性基团未明显改变。

图2 我国四大矿区天然温石棉矿物粉体的电镜扫描图片Fig.2 Scanning electron microscope images of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China

图3 我国四大矿区天然温石棉不同研磨时间后矿物粉体的FTIR分析Fig.3 The FTIR analyses of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China at different grinding time spans

2.4 常量化学成分检测

我国四大矿区天然温石棉常量化学成分相似(表2)，主要由 SiO2和 MgO组成，还含有少量的Fe2O3、Al2O3。茫崖和新康温石棉SiO2含量高于阿克塞和陕南温石棉，并且含较多Al2O3和Fe2O3。陕南温石棉中SiO2含量最低，MgO含量最高。

2.5 微量元素检测

表2显示，我国四大矿区天然温石棉矿物粉体的微量元素相似，主要含有 Cr、Ni、Mn、Ti和 P 等元素。阿克塞和茫崖温石棉含有较多的Cr和Ni，陕南温石棉含有较多的Mn，新康温石棉含有较多的P、Ti和Zr。

表2 我国四大矿区天然温石棉矿物粉体的主量(w B/%)和微量(w B/10-6)元素含量Table 2 Main chemical composition analysis(w B/%)and trace chemical element conteat(w B/10-6)of four natural chrysotile asbestos in major mining areas in China

2.6 温石棉染毒大鼠BALF中LDH、AKP和TP含量的变化

表3显示，染毒1个月时，与阴性对照组比较，阿克塞、茫崖和新康温石棉组BALF中LDH增高(P＜0.05)，各温石棉组 AKP和 TP含量增高(P＜0.05)，且茫崖温石棉组LDH高于其余温石棉组(P＜0.05)，新康温石棉组LDH高于陕南温石棉组(P＜0.05)，茫崖温石棉组AKP高于其余温石棉组(P＜0.05)，阿克塞、茫崖和新康温石棉组TP高于陕南温石棉组(P＜0.05);染毒6个月和12个月时，与阴性对照组比较，各温石棉组LDH、AKP和TP含量均增高，且温石棉组两两之间比较均有差异(P＜0.05)，茫崖和新康温石棉组高于阿克塞和陕南温石棉组(P＜0.05)。阿克塞、茫崖和新康温石棉组的LDH以及各温石棉组AKP、TP含量都随着染毒时间延长呈上升趋势(P＜0.05)。

2.7 HO-1、HSP-70的mRNA和蛋白表达水平

染毒1个月时，与阴性对照组比较，各温石棉组大鼠肺组织中HO-1、HSP-70 mRNA以及HO-1、HSP-70蛋白表达水平均增高(P＜0.05)，且温石棉组两两之间比较无差异(P＞0.05);染毒6个月时，与阴性对照组比较，各温石棉组增高，且阿克塞和陕南温石棉组低于茫崖和新康温石棉组(P＜0.05)。染毒12个月时，与阴性对照组比较，茫崖和新康温石棉组降低，且阿克塞和陕南温石棉组高于茫崖和新康温石棉组(P＜0.05)(图4)。

表3 我国四大矿区天然温石棉对大鼠BALF中LDH、AKP和TP含量的影响(n=6，x±s)Table 3 Effects of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China on the content of lactate dehydrogenase，alkaline phosphatase and total protein in alveolar lavage fluid of rats(n=6，x±s)

图4 我国四大矿区天然温石棉对大鼠肺组织HO-1、HSP-70的蛋白和mRNA表达的影响(n=6，x±s)Fig.4 Effects of four natural chrysotile asbestos in major mining areas in China on the expression of HO-1 and HSP-70 protein and mRNA in rat lung tissue(n=6，x±s)

3 讨论

BALF成分的变化可以较为敏感地反映肺对吸入毒物的反应和肺受损程度。LDH属胞浆酶，当肺部组织受到损伤时，血液或组织液渗漏到肺泡可导致LDH漏出量增多，从而作为反映毒物毒性的早期灵敏指标。AKP是一种常见的免疫标志酶，中性粒细胞浸润程度和肺泡Ⅱ型细胞受损程度与AKP含量的改变呈正比关系;血浆渗出的蛋白质是BALF中TP的主要来源，它能够作为肺部血管通透性的指标，肺泡上皮-毛细血管屏障损伤的程度可通过TP含量的变换来反映。本实验结果显示，阿克塞、茫崖和新康温石棉组LDH以及各温石棉组AKP和TP含量在各时间点高于阴性对照组且都随着染毒时间延长呈上升趋势。徐斌(2016)在探讨细颗粒物PM2.5对人肺泡上皮细胞A549损伤的研究中发现，随着染毒浓度和时间的增加，LDH含量增加，说明细颗粒物PM2.5对人肺泡上皮细胞A549的损伤可以引起LDH增加。Wang G等(2013)在探讨臭氧和细颗粒物暴露对大鼠肺部影响的实验中发现，染毒3周后大鼠BALF中AKP和TP的含量与阴性对照组相比增加明显，提示臭氧和细颗粒物联合暴露会造成大鼠肺部损伤。在实验中也发现随着染毒时间的延长，我国不同矿区的4种温石棉染毒组BALF中AKP和TP的含量增多。综上，大鼠暴露于温石棉后，BALF中LDH、AKP和TP含量发生了变化，这说明我国四大矿区天然温石棉可导致大鼠肺部生化功能障碍，温石棉进入肺部后可通过改变中性粒细胞和肺泡Ⅱ型细胞的细胞膜通透性或使细胞受损，使各种细胞酶渗出增加，对肺组织具有毒性损伤作用，在一定程度上可导致大鼠肺泡上皮-毛细血管屏障损伤及肺部炎症。

HO-1对多种呼吸系统疾病有保护作用，HSP-70作为分子伴侣参与细胞调控和维持细胞内多种蛋白的正确构象及功能，具有减轻肺损伤的生物学功能。我国四大矿区天然温石棉可造成大鼠肺部损伤，那么对肺组织中HO-1和HSP-70表达有何影响?本实验结果显示，各温石棉组在染毒1和6个月时大鼠肺组织 HO-1、HSP-70 mRNA和 HO-1、HSP-70蛋白表达量与阴性对照组比显著增高。有研究观察到小鼠急性暴露于细颗粒物PM2.5后，肺组织中HO-1、HSP-70蛋白的表达量高于阴性对照组(Farina et al.，2011;Sancini et al.，2014)，大鼠气管内滴注TiO2纳米粒子或石棉纤维后，大鼠肺部HO-1 mRNA和HO-1蛋白含量均增加(Obata et al.，2011;Yoshiura et al.，2015)，以上都提示颗粒物和纤维物质造成肺部损伤可能与HO-1和HSP-70有关。而有研究报道肺组织中HO-1和HSP-70表达的减少意味着肺部生物转化或解毒作用变缓慢(Beere et al.，2000;Li et al.，2005)，本研究结果显示，青海茫崖和四川新康温石棉组HO-1、HSP-70 mRNA和HO-1、HSP-70蛋白表达量在染毒12个月时比阴性对照和阿克塞和陕南温石棉组低。这可能是其对肺组织损伤作用较强引起解毒和修复作用缓慢导致的。由此推测，当机体受到温石棉纤维短时间刺激时，产生应激反应使HO-1、HSP-70保护性机制启动，通过表达量增加来减轻细胞的损伤，但是长时间毒性较强的温石棉刺激可能削弱了机体免疫监视及清除功能，导致HO-1、HSP-70 mRNA和 HO-1、HSP-70蛋白表达量下降。

Sporn(2011)和Hamra等(2017)发现肺组织的损伤与温石棉纤维的结构、尺寸大小和生物持久性有关。本研究结果显示，我国四大矿区天然温石棉矿物粉体大多排列成细长纤维束状。Li和Fukagawa(2010)认为温石棉纤维可通过呼吸进入肺内，如不能排出，可被肺泡巨噬细胞吞噬或穿透上皮细胞而进入肺间质，从而在体内持续停留很长时间造成肺部损伤，提示温石棉纤维可能对大鼠肺部造成不同程度的机械损伤。本研究采用的是未提纯的4种天然温石棉，X射线荧光光谱分析显示阿克塞、茫崖、新康温石棉主要含有SiO2和MgO，陕南温石棉中的SiO2含量较低，MgO含量较高，杂质含量不同可能是各温石棉样品成分不同的原因之一。Darne等(2016)通过微核实验和彗星实验证实了SiO2的遗传毒性，提示温石棉毒性强弱可能和SiO2含量有关。4种温石棉成分对比显示，陕西陕南温石棉中MgO含量较高，SiO2含量较低，前期课题组XRD结果(Zeng et al.，2018)显示陕南温石棉中含水镁石，这可能是其MgO含量较高的原因之一。孟丽娟等(2005)发现Mg可维护膜结构的完整性，对大鼠肺损伤有保护作用，提示Mg含量较高可能是陕西陕南温石棉毒性较弱的原因。本研究中茫崖、新康温石棉主要含有较多的Al2O3和Fe2O3。Huo等(2018)推测Al2O3可增强纤维的毒性，Toyokuni(2014)发现涂铁石棉纤维能像锋利的刀一样使间皮细胞内的DNA双键断裂，巨噬细胞和间皮细胞里Fe2+的长期沉积能够诱发氧化应激，从而促进致癌作用，它们均提示Al2O3和Fe2O3含量较高可能是茫崖、新康温石棉毒性较高的原因。本研究微量元素检测结果显示，茫崖温石棉含有最多的Cr、Ni，其次是阿克塞、新康和陕南温石棉，四川新康温石棉含有较多Ti。温石棉中的微量元素可进入肺部的弱酸环境并溶解，因此微量元素的局部浓度增加了生物毒性(Zeng et al.，2018)。有研究表明Cr、Ni等元素可能与肿瘤发生有关(Scimeca et al.，2014;Cao et al.，2016;Halasova et al.，2016;Tomioka et al.，2016)，Sun 等(2012)发现小鼠暴露于TiO2纳米粒子90天后发生了炎症反应和氧化应激肺毒性反应它们均提示较多的Cr、Ni和Ti微量元素可能是茫崖和新康温石棉毒性较高的原因。