HER2分子影像探针99m Tc-HP7的放射性标记与肿瘤SPECT/CT显像

宋宏杰 ，张 健 ，石 琴 ，周治国，王明伟

1.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；2.复旦大学生物医学影像研究中心，上海 200032；

3.上海分子影像探针工程技术研究中心，上海 200032；

4.上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234

人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在多种癌症中过表达，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌等［1］，使得相关肿瘤具有恶性程度高、侵袭力强、易转移、预后差等特点。目前，HER2是重要的肿瘤分子靶点，而且HER2靶向抗体药物已被纳入关键的临床治疗方案，因此，肿瘤诊断和靶向治疗均需要有效的HER2表达检测方法。

目前，临床检测HER2的常用方法是免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）。然而，两者均有一定局限性，包括由于活检取样导致的创伤性和取样误差，不能多次、动态取样检查，通常只能在原发灶取样而不能在其他转移灶取样，无法进行全身评价［2］，因而缺乏整体、动态等系统性观察能力。研究［1］表明，肿瘤HER2表达具有明显的异质性，即HER2表达在原发病灶的不同区域内、原发肿瘤和转移肿瘤之间、不同转移灶之间及不同患者之间等都可能是不同的和变化的。分子影像检查可以实时、全面、无创、实时定量地检测HER2表达，为克服上述问题提供了有效的解决途径，特别是高灵敏度的、基于放射性核素的核医学分子影像检查［3］。

核素标记HER2抗体是目前主要的HER2靶向分子影像探针。然而，抗体相对分子质量大（约150×103），血液清除速度慢，成像时间长（通常为注射后3～5 d），给使用带来不便。多肽则易于制备和储存，性质稳定，而且相对分子质量小，血液清除快，具有开发为分子影像探针的理想性质［4］。因此，核素标记HER2靶向性多肽是HER2分子影像探针的重要发展方向，具有注射后及时成像的特点，临床应用潜力很大。

基于组合多肽文库技术的研究［5］发现，一种序列模型为LTVXPWX的7肽可与HER2阳性乳腺癌细胞发生明显的结合和内吞作用［6］，特别是其中LTVSPWY序列的亲和力最强［7］。本研究选取该七肽为HER2靶向配体，经过螯合剂HYNIC修饰，实现核素99mTc标记，获得HER2分子影像探针99mTc-HYNIC-LTVSPWY（99mTc-HP7），并开展其不同HER2表达水平的肿瘤单光子发射型计算机断层显像/计算机断层扫描（single-photon emission computed tomography/computed tomography，SPECT/CT）显像及其肿瘤摄取与HER2表达相关性的研究。

1 材料和方法

1.1 试剂与器材

委托上海科肽生物科技有限公司合成HYNIC-LTVSPWY（HP7）衍生物；无水氯化亚锡和三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine）购自北京百灵威科技有限公司；乙二胺二乙酸（EDDA）来源于东京化成工业株式会社；高锝酸钠（Na99mTcO4）购自上海原子科兴药业有限公司。所有化学试剂均为分析纯，没有进一步纯化直接使用。

采用美国Agilent Technologies公司的1260 Infinity高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC），拉脱维亚Biosan公司的TS-100恒温振荡器，美国Waters公司Seppak®Plus C18柱；美国CRPINTEC公司CRC-25R活度计，德国Merck公司TLC Silica gel 60 F254铝基硅胶板，德国Raytest公司miniGita Star放射性薄层色谱扫描仪（radioactive thin layer chromatography，Radio-TLC），美国Bioscan公司Nano SPECT/CT PLUS小动物SPECT/CT。

1.2 HP7的准备与分析

HPLC分析条件：分析柱为ZORBAX 300SBC18柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm），流动相由溶液A［0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的水溶液］和溶液B（0.1% TFA的乙腈溶液）组成，浓度梯度为0 min（80%A，20%B）、25 min（15%A，85%B）、30 min（0%A，100%B）、35 min（0%A，100%B），流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，紫外检测波长为214 nm。

1.3 99mTc-HP7放射性标记

为了标记99mTc-HP7，取含有20 μg HP7的Eppendorf试管，加入500 μL EDDA（20 mg/mL，溶于0.1 mol/L NaOH溶液）和500 μL Tricine（40 mg/mL，溶于0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH=6.0），混匀；再加入Na99mTcO4溶液（约5 mCi，1 Ci=3.7×1010Bq），混匀；再加入5 μL SnCl2（1.0 mg/mL，溶于0.1 mol/L HCl溶液），混匀，于100 ℃下加热反应15 min。

如果反应不完全时，采用Sep-Pak C18柱分离纯化。将反应液加入预处理的C18柱，先用5～10 mL水淋洗，再用1～2 mL乙醇淋洗，加热挥发出去乙醇，加入1～3 mL 0.9%的NaCl溶液溶解，获得99mTc-HP7注射液。

利用Radio-TLC分析99mTc-HP7的标记率和放射化学纯度。将反应液点样于硅胶板，分别以丙酮、0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=5.0）和甲醇/乙酸铵（体积比为1∶1）作为展开剂。

1.4 体外稳定性实验

取100 μL99mTc-HP7溶液分别加入至等体积的0.9% NaCl溶液和马血清中，于37 ℃分别温育1、3、6、18及24 h。在每个时间点，将溶液点样在硅胶板上，以0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=5.0）为展开剂，进行Radio-TLC分析，测定各个时间点的放化纯度。

1.5 SPECT/CT显像

根据参考文献［8］，选择HER2表达水平不同的人胃癌NCI-N87、卵巢癌SKOV-3和结肠癌HT-29细胞系均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，分别用包含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基、McCOY’s 5A培养基和McCOY’s 5A培养基培养。将细胞培养瓶置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中，每过48 h细胞传代1次，处于对数生长期的细胞用于实验。

5周龄BLAB/c裸小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，将处理好的NCI-N87、SKOV-3和HT-29细胞分散在PBS溶液中，取0.1 mL细胞悬液（1×107个细胞） 注射于裸小鼠右前肢皮下。肿瘤生长至长径0.5～1.0 cm，用于SPECT/CT成像实验。

采用快速截留超绿-超红方法(以下用FIE表示)，即EGR2中的3G和2.4R的值若大于255，则看作255，计算得到的ExG - ExR2值只能够保留大于0的像素[7]。

各取3只NCI-N87、SKOV-3和HT-29模型鼠，将0.9～1.1 mCi99mTc-HP7溶液经尾静脉注射到荷瘤鼠体内，分别于注射后0.5、1.0和3.0 h进行SPECT/CT显像。分析肿瘤（T）及对侧肌肉（M）的放射性摄取%ID/g值，并计算T/M比值。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）和免疫组织化学实验

分别选择并处死3只NCI-N87、SKOV-3和HT-29模型荷瘤鼠，剥离获取肿瘤组织，用于Western blot实验的瘤块冻存于-80 ℃，用于免疫组织化学分析的瘤块置于4%多聚甲醛固定。所有瘤块委托上海晶莱生物技术有限公司处理，最终获得Western blot条带图及免疫组织化学图像（×200）。利用Image J软件分析Western blot条带图的灰度值，采用Image Pro Plus软件分析免疫组织化学图像中HER2阳性率（average optical density，AOD）=阳性区域光密度值（integral optical density，IOD）/视野面积（mm2）。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 HP7的纯度

HPLC分析结果显示，HP7的纯度大于95%（图1），冷冻干燥后易于保存，有利于后续的放射性核素99mTc标记实验。

2.2 99mTc-HP7的标记率和放射化学纯度

99mTc-HP7标记反应液在不同展开体系中的Radio-TLC谱图见图2。丙酮为展开剂时，只有未标记的游离99mTcO4移到前沿，99mTc胶体、99mTc-HP7肽和99mTc-共配体复合物三者均处于原点。0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=5.0）为展开剂时，游离99mTcO4和99mTc-共配体复合物二者移到前沿，99mTc-胶体和99mTc-HP7仍然处于原点。甲醇/乙酸铵（体积比为1∶1）为展开剂，99mTcO4、99mTc-共配体复合物和99mTc-HP三者一起移到前沿，只有99mTc-胶体处于原点［9］。根据3种展开体系Radio-TLC谱图主峰的百分比，可以计算出99mTc-HP7肽的标记率大于95%。说明99mTc-HP7肽的标记率高，不需要进一步分离纯化，所得99mTc-HP7溶液的放射化学纯度大于95%，能够满足后续的体内显像实验。

图1 HP7的HPLC分析谱图

2.3 99mTc-HP7的体外稳定性

图3是99mTc-HP7在24 h内的体外稳定性曲线，反映不同时间点99mTc-HP7的放射化学纯度的变化。99mTc-HP7在0.9%的NaCl溶液和马血清两种体系中的稳定性在6 h以内都保持在95%以上，在24 h内大于85%以上。因此，99mTc-HP7具有良好的体外稳定性，可用于体内显像实验。

图2 99mTc-HP7标记溶液的Radio-TLC谱图

图3 99mTc-HP7的体外稳定性

2.4 肿瘤模型99mTc-HP7 SPECT/CT显像

图4是注射后不同时间3种肿瘤模型NCI-N87（A）、SKOV-3（B）和HT-29（C）的99mTc-HP7 SPECT/CT图像。99mTc-HP7在NCI-N87、SKOV-3和HT-29肿瘤内显像信号依次降低。定量分析发现，对于NCI-N87和SKOV-3模型，注射后1 h99mTc-HP7的肿瘤摄取较高（大于1.0%ID/g），3 h时明显降低，同时全身血液清除基本完全，因此3 h时靶本比最高，表现出较好的肿瘤靶向性和较高的图像对比度。对于HT-29模型，99mTc-HP7的肿瘤摄取较低（小于1.0%ID/g），并随着时间快速减少，其靶本比较低，肿瘤显像不明显。

2.5 肿瘤组织HER2表达的Western blot和免疫组织化学检测

从Western blot条带图（图5）可知，反映NCI-N87（左）、SKOV-3（中）和HT-29（右）肿瘤组织HER2表达的条带灰度依次降低，其半定量分析得到3种肿瘤组织对应的条带相对灰度值分别为1.27、0.44和0.13。该实验结果表明，NCI-N87、SKOV-3和HT-29肿瘤组织的HER2表达水平明显不同，呈现高、中、低依次降低的趋势。

图4 肿瘤模型99mTc-HP7 SPECT/CT图像及其定量分析

图5 肿瘤组织HER2表达的Western blot条带图（A）及定量灰度值分析（B）

免疫组织化学染色结果（图6）清楚地显示NCI-N87、SKOV-3和HT-29这3种肿瘤组织的不同程度的HER2表达，对应的定量AOD值依次降低，这与Western blot结果一致。同时，H-E染色结果显示，肿瘤组织形态正常，无明显坏死现象。

由于99mTc-H P 7是H E R 2靶向探针，NCI-N87、SKOV-3和HT-29肿瘤组织的HER2表达水平是其肿瘤摄取的关键因素，因此我们研究了99mTc-HP7的肿瘤摄取与HER2表达水平的相关性。相关性分析所示，两者之间呈现明显的正相关性（r=1.000），且差异有统计学意义（P＜0.05，图7）。

图6 肿瘤组织的H-E染色（A）与HER2免疫组织化学染色（B）及其定量AOD值分析（C）

图7 肿瘤摄取与HER2表达水平的相关性分析

3 讨 论

研究［10］发现，HER2在乳腺癌等多种常见肿瘤中高表达，这类肿瘤具有恶性程度高、进展快、易出现早期复发转移和患者生存率低的特点。近年来，靶向HER2单克隆抗体已经成功地应用于临床治疗［11］，比如曲妥珠单抗，可显著提高HER2阳性肿瘤患者的生存率。因此，有效检测HER2表达状态和动态变化对于精准肿瘤诊断、靶向治疗患者选择和疗效评价具有非常重要的意义。

为了开展HER2靶向分子影像，本研究利用放射性核素99mTc标记HER2靶向多肽HP7，开发了HER2阳性肿瘤SPECT/CT分子影像探针99mTc-HP7。它具有多个方面的优势：①99mTc是临床肿瘤核医学显像诊断使用最多的核素，来源于发生器，方便易得，已发展了多样化的标记方法；② SPECT/CT是较为普及的临床核医学显像诊断仪器，费用较低，较为普惠，有利于应用推广；③ 与核素标记单克隆抗体类分子影像探针的相对分子质量大、血液清除慢、最佳显像时间较长、生产难度大且成本高等不足相比，核素标记多肽类探针具有相对分子质量小、血液清除快、注射后及时显像、易于生产且成本低等优势。

本研究采用基于螯合剂的方法实现了99mTc-HP7的放射性标记制备。目前，99mTc标记方法主要包括直接标记法［12］和间接标记法［13］。对于直接标记，99mTc通过生物分子中的多个供体基团（-COOH、-NH2-，-OH等）直接与其连接，存在稳定性较差的问题［12］。对于间接标记，99mTc通过双功能螯合剂连接与多肽等形成较为稳定的结合，同时具有方法简便、反应条件温和、标记率高等特点。因此，本研究使用间接方法从而避免99mTc标记对肽和靶分子生物活性的影响。需要指出的是，HYNIC作为螯合剂时，需要引入其他共配体参与螯合以形成稳定的络合物。文献［14-16］报道，选用Tricine和EDDA作为共配体，有利于提高标记率和稳定性，这也成为本研究制备99mTc-HP7的方法基础。

根据荷瘤鼠全身SPECT/CT显像，本研究发现，99mTc-HP7的体内生物分布以肾脏和肠道分布代谢为特征。99mTc-HP7在肾脏和膀胱的放射性显像信号很高，这与它的相对分子质量小有关，符合多肽在体内主要通过肾脏代谢的一般特点。99mTc-HP7在胆囊和肠道的分布较高，这与HP7序列富含脂肪烃基和芳香基而亲脂性较高的性质吻合，也与类似文献报道［17］一致。

为了验证基于99mTc-HP7标记的SPECT/CT显像肿瘤HER2表达的可行性，本项研究开展了3种HER2表达不同的肿瘤（胃癌NCI-N87、卵巢癌SKOV-3和结肠癌HT-29）显像。实验结果表明，这3种显像信号依次降低，其中HER2表达较高的NCI-N87和SKOV-3肿瘤显像清楚，而HER2表达低的HT-29肿瘤显像不明显。Western blot和免疫组织化学实验均证实了3种肿瘤组织HER2表达呈高、中、低的水平，说明HER2介导99mTc-HP7特异性摄取，同时也解释了实验肿瘤摄取99mTc-HP7肽探针高低的原因，与类似探针的报道［18］一致。进一步的相关性分析发现，99mTc-HP7肿瘤摄取与HER2表达水平呈现良好的正相关关系。

综上所述，本研究开发了HER2阳性肿瘤SPECT/CT分子影像探针99mTc-HP7，其制备方法简便，标记效率高，肿瘤靶向性良好，且与肿瘤HER2表达水平有关，能够实现在体内HER2表达水平显像。总之，99mTc-HP7表现出较为理想的探针性质及显像效果，具有作为HER2分子影像探针的潜力。