核因子E2相关因子2-醌氧化还原酶1抑制ferroptosis缓解肠缺血再灌注诱导的急性肺损伤

董 惠 胡 蓉

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是严重威胁重症患者生命的常见疾病，目前仍主要依赖机械通气治疗，但疗效不佳，病死率接近于 50%[1]。肠缺血再灌注(intestine ischemia reperfusion, IIR)是导致肠道手术、心肺转流、创伤与急性失血等多种临床并发症造成多器官损伤的主要原因。已有研究[2-3]结果表明，IIR可破坏肠道黏膜屏障，造成大量内毒素和炎性因子释放入血液循环，诱导首要被攻击的靶器官肺脏的肺泡上皮屏障遭受破坏，使肺水转运和免疫防御功能受损，IIR导致的ALI是危重病研究领域中的难点和热点。

ferroptosis是一种独特的细胞死亡方式，因依赖铁离子而得名，受细胞内信号通路的严密调控[4]。ferroptosis作为一种非凋亡的细胞死亡模式，以脂质活性氧(reactive oxidative species，ROS)的积累为特征[5]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相互作用调节编码抗氧化蛋白，是内源性抗氧化应激的核心通路[6]。本研究通过观察小鼠静脉注射柠檬酸铁或ferroptosis抑制剂ferrostatin-1后肺组织病理损伤情况,以及Nrf2-醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1]蛋白质的表达情况，探讨肺损伤修复的新策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理委员会审查批准(SH9H-2019-A634-1)。8周龄健康雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠(简称WT小鼠)32只，均购于上海交通大学医学院附属第九人民医院动物实验中心。Nrf2基因敲除小鼠32只，由RIKEN生物资源中心通过国家生物资源项目提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备和分组 取32只健康雄性WT小鼠随机分为假手术组、模型组、模型+铁剂组(铁剂组)和模型+ferroptosis抑制剂组(ferroptosis抑制剂组)，每组8只。IIR模型建立：术前禁食12 h，以戊巴比妥钠50 mg/kg经腹腔内注射麻醉，取腹部正中切口，用无创血管夹阻断肠系膜上动脉45 min，开放再灌注 180 min。假手术组仅暴露肠系膜上动脉，不予结扎；铁剂组和ferroptosis抑制剂组于阻断肠系膜上动脉前30 min经尾静脉分别注射ferroptosis诱导剂柠檬酸铁15 mg/kg和ferroptosis抑制剂ferrostatin-1 5 mg/kg。取32只Nrf2基因敲除小鼠(Nrf2-/-小鼠)亦分为假手术组、模型组、铁剂组和ferroptosis抑制剂组，各组处理方法与WT小鼠一致。

1.2.2 标本采集和肺干湿比重(W/D)计算 模型制备成功后处死小鼠，取其右上肺叶称湿重，置于80 ℃烘箱中烘烤72 h至恒重，取出后称干重，计算肺W/D值。

1.2.3 Western印迹法检测肺组织Nrf2、NQO1蛋白质表达 肺组织称重，用液氮研磨至粉末，加蛋白裂解液30 min，冰浴匀浆，4 ℃ 12 000 ×g离心5 min，取上清液，采用Bradford法行蛋白质定量，置于-80 ℃冰箱保存备用。将20 μg蛋白质样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入一抗(Nrf2 1∶1 000，NQO1 1∶1 000)置于4 ℃封闭过夜；以Tris缓冲液冲洗膜5 min，反复3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗IgG (1∶2 000)，于室温下孵育1 h，再以Tris缓冲液洗膜5 min，反复3次。充分洗膜后经电化学发光(ECL)显影，于X线下压片、 曝光，应用Image J 软件分析条带。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测Nrf2、NQO1的mRNA表达 按照TRIzol试剂说明书提取总RNA，使用Prime Script realtime-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)进行cDNA合成。应用CFX384实时系统(美国Bio-Rad公司)使用SYBR mix(美国Bimake公司)进行实时荧光定量PCR分析。扩增方案：95 ℃ 5 min的单循环；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；最后95 ℃ 10 s的单循环。完毕后，明确扩增曲线、熔解曲线，PCR反应结束后读取Ct值，利用荧光定量检测仪计算2-ΔΔCt，分析各个样本中Nrf2、NQO1的表达情况。引物序列：Nrf2正向引物为5’-TAG AGT CAG CAA CGT GGA AG-3’，反向引物为5’-TAT CGA GGC TGT GTC GAC TG-3’；NQO1正向引物为5’-AGG ATG GGA GGT ACT CGA ATC-3’， 反向引物为5’-TGC TAG AGA TGA CTC GGA AGG-3’；GAPDH正向引物为5’-AAG AAG GTG GTG AAG CAG G-3’，反向引物为5’-GAA GGT GGA AGA GTG GGA GT-3’。

1.2.5 肺组织病理学观察 取小鼠新鲜左肺组织，以4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水渗透，石蜡包埋后切片，切片厚度为5 μm。经H-E染色后置于光学显微镜(×200)下观察肺组织病理学变化。将每张切片分为 9 个视野，随机选取3个视野，参照文献[7]的方法通过累加各指标相应分数计算肺组织损伤病理学评分评价小鼠肺损伤程度。

2 结 果

2.1 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各组肺组织病理学表现 WT小鼠假手术组、模型组、铁剂组、ferroptosis抑制剂组的肺组织损伤病理学评分分别为(5.00±0.50)、(8.00±0.71)、(14.75±0.35)、(3.75±0.35)分，Nrf2-/-小鼠分别为(4.75±0.35)、(11.75±0.40)、(19.25±0.76)、(4.50±0.71)分。WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型组和铁剂组的肺组织损伤病理学评分分别显著大于同种小鼠假手术组和ferroptosis抑制剂组(P值均<0.05)，铁剂组的肺组织损伤病理学评分分别显著大于同种小鼠模型组(P值均<0.05)；Nrf2-/-小鼠模型组和铁剂组的肺组织损伤病理学评分分别显著大于WT小鼠模型组和铁剂组(P值均<0.05)。肺组织H-E染色显示：WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手术组肺组织结构正常；模型组肺毛细血管明显扩张、充血，炎性细胞浸润；铁剂组肺泡壁破坏严重，肺间质水肿，肺泡间隔增宽；ferroptosis抑制剂组肺泡间隔增宽，组织损伤较模型组明显减轻。Nrf2-/-小鼠模型组和铁剂组肺损伤程度较WT小鼠模型组和铁剂组严重。见图1。

2.2 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各组肺组织W/D值 WT小鼠假手术组、模型组、铁剂组、ferroptosis抑制剂组的肺组织W/D值分别为3.54±0.75、8.40±0.90、11.20±0.83、5.50±0.50，Nrf2-/-小鼠分别为4.23±0.35、11.60±0.90、14.02±0.55、7.13±0.42。WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型组和铁剂组的肺组织W/D值分别显著大于同种小鼠假手术组和ferroptosis抑制剂组(P值均<0.05)，铁剂组的肺组织W/D值分别显著大于同种小鼠模型组(P值均<0.05)；Nrf2-/-小鼠模型组和铁剂组的肺组织W/D值分别显著大于WT小鼠模型组和铁剂组(P值均<0.05)。

A WT小鼠假手术组 B WT小鼠模型组 C WT小鼠铁剂组 D WT小鼠ferroptosis抑制剂组 E Nrf2-/-小鼠假手术组 F Nrf2-/-小鼠模型组 G Nrf2-/-小鼠铁剂组 H Nrf2-/-小鼠ferroptosis抑制剂组图1 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各组肺组织病理学表现(H-E染色，×200)

2.3 WT小鼠各组肺组织Nrf2、NQO1蛋白质和mRNA表达 WT小鼠模型组和铁剂组的肺组织Nrf2、NQO1蛋白质相对表达量和mRNA相对表达量均显著高于假手术组和ferroptosis抑制剂组(P值均<0.05)，铁剂组的肺组织Nrf2、NQO1蛋白质相对表达量和mRNA相对表达量均显著高于模型组(P值均<0.05)。见图2和表1。

2.4 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手术组和模型组肺组织NQO1蛋白质相对表达量 另取WT小鼠和Nrf2-/-小鼠各8只按前述模型制备方法分别分为假手术组和模型组，每组4只。WT小鼠假手术组、模型组的肺组织NQO1蛋白质相对表达量分别为0.12±0.03、0.27±0.05，Nrf2-/-小鼠假手术组、模型组分别为0.03±0.02、0.15±0.12。WT小鼠和Nrf2-/-小鼠模型组的肺组织NQO1蛋白质相对表达量分别显著高于同种小鼠假手术组(P值均<0.05)，Nrf2-/-小鼠模型组的肺组织NQO1蛋白质相对表达量显著低于WT小鼠模型组(P<0.05)。见图3。

1 假手术组 2 模型组 3 铁剂组 4 ferroptosis抑制剂组图2 WT小鼠各组肺组织Nrf2、NQO1蛋白质表达情况

表1 WT小鼠各组肺组织Nrf2、NQO1蛋白质和mRNA相对表达量比较

组别Nrf2蛋白质相对表达量NQO1蛋白质相对表达量Nrf2 mRNA相对表达量NQO1 mRNA相对表达量假手术0.39±0.020.46±0.050.78±0.310.56±0.09模型0.70±0.03①②0.94±0.12①②3.47±0.12①②1.07±0.06①②铁剂0.95±0.07①②③1.47±0.10①②③4.59±0.14①②③2.13±0.36①②③ferroptosis抑制剂0.39±0.010.60±0.032.29±0.370.63±0.01

与假手术组比较：①P<0.05。与ferroptosis抑制组比较：②P<0.05。与模型组比较：③P<0.05

3 讨 论

作为对缺血非常敏感的器官，肠道极易因创伤性失血、休克、感染等各种因素诱发缺血再灌注损伤，在多器官功能障碍的病理生理发展过程中，释放大量内毒素和炎性因子进入淋巴和血液循环[8]。由于肠系膜淋巴液进入血液后首先经过肺，故IIR后最早发生功能紊乱的脏器就是肺，如ALI和ARDS，全身多器官功能障碍中肺部表现最为突出[9]。IIR诱导的ALI发生时，肠道组织缺氧反应性产生并释放氧自由基和炎性因子，可直接导致Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体功能发生障碍，引起肺泡表面活性物质减少，以及肺泡上皮钠离子通道、Na+-K+-ATP 酶和水通道等水钠转运系统的功能发生障碍[10]。值得关注的是，高氧化应激状态下大量ROS释放，也可导致Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体内脂质过氧化物堆积，诱导细胞发生ferroptosis，加重肺损伤。本研究结果显示,WT小鼠、Nrf2-/-小鼠模型组肺组织W/D值和肺组织损伤病理学评分均显著高于同种小鼠假手术组，表明氧化应激反应参与了IIR诱导的ALI过程。ferroptosis是一种具有铁离子依赖性，在小分子物质诱导下发生的氧化性细胞死亡，其发生是细胞内脂质ROS生成与降解平衡失调所致[5]。ferroptosis在缺血再灌注损伤性疾病中发挥关键作用。Gao等[11]研究发现，通过抑制谷氨酰胺代谢抑制ferroptosis能够改善缺血再灌注引起的心肌损伤。在缺血再灌注肾损伤模型的研究[12]中发现，细胞ferroptosis显著增加并进一步加重肾损伤。然而，ferroptosis在ALI中作用的相关研究较少。目前仅有体外研究[13]显示，内毒素显著破坏体内铁平衡，上调肺泡上皮细胞内铁蛋白水平可减轻过量铁离子堆积引发的细胞毒性。在本研究中，分别给予小鼠静脉注射ferroptosis诱导剂柠檬酸铁15 mg/kg或ferroptosis抑制剂ferrostatin-1 5 mg/kg后，能加重或减轻小鼠肺损伤，表明ferroptosis参与IIR诱导的ALI进程。

1 WT小鼠假手术组 2 WT小鼠模型组 3 Nrf2-/-小鼠假手术组 4 Nrf2-/-小鼠模型组图3 WT小鼠和Nrf2-/-小鼠假手术组和模型组肺组织NQO1蛋白质表达情况

Nrf2是普遍存在的转录因子，作为细胞内维持氧化稳态的关键调控因子在高氧化应激状态下被持续激活，通过与细胞核内ARE结合，促进靶基因转录、抗氧化和抗炎蛋白翻译，从而发挥细胞保护作用[14]。有研究[15]结果显示，Nrf2/血红素加氧酶1(HO-1)/NQO1信号通路是Nrf2提高抗氧化酶活力，减轻氧化应激损伤的重要机制。本研究结果显示，WT小鼠模型组和铁剂组的肺组织Nrf2、NQO1蛋白质相对表达量和mRNA相对表达量均显著高于假手术组和ferroptosis抑制剂组，铁剂组的肺组织Nrf2、NQO1蛋白质相对表达量和mRNA相对表达量均显著高于模型组；提示铁剂能诱导Nrf2和NQO1在造模后的表达进一步增加，而ferroptosis抑制剂则能降低其表达。同时，Nrf2-/-小鼠模型组的肺组织NQO1蛋白质相对表达量显著低于WT小鼠模型组，表明Nrf2是通过提高NQO1的表达来抑制ferroptosis。

综上所述，Nrf2能够通过增加NQO1的表达有效抑制ferroptosis，从而减轻IIR所致的ALI。