生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对干腌羊火腿微生物菌相变化的影响

阿尔祖古丽·阿卜杜外力　玉素甫·苏来曼　巴吐尔·阿不力克木

摘 要：研究生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对干腌羊火腿微生物菌相变化的影响。采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对鲜羊腿（0 d）、腌制3 d以及对照组、生姜蛋白酶添加量0.05%组（S组）、猕猴桃蛋白酶添加量0.05%组（M组）风干前期（8 d）、风干中期（15 d）、风干后期（23 d）、成熟期（30 d）工艺点的干腌羊火腿微生物菌相变化进行测定。结果表明：腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、表皮巨球菌（Macrococcus epidermidis）、土壤葡萄球菌（S. edaphicus）、哈夫尼亚菌（Hafnia paralvei）、明串珠菌（Leuconostoc gelidum）是各组干腌羊火腿的优势菌，其中葡萄球菌属种类较多;2 种蛋白酶可丰富干腌羊火腿微生物的种类;生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶处理组成熟30 d时均出现木糖葡萄球菌（S. xylosus）;在整个加工过程中，干腌羊火腿微生物菌相变化较稳定，受2 种蛋白酶的影响不大。

关键词：干腌羊火腿;生姜蛋白酶;猕猴桃蛋白酶;聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳;菌相变化

Effect of Zingibain and Actinidin on Microfloral Changes during Processing and Ripening of Dry-Cured Mutton Ham

Aerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU*

（College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， ?rümqi 830052， China）

Abstract： This work studied the effects of zingibain and actinidin on microfloral changes during the processing and ripening of dry-cured mutton ham. Fresh and three-day salted Biceps femoris muscles as well as samples from the control， 0.05% zingibain and 0.05% actinidin addition groups taken at the early （day 8）， middle （day 15） and later stages （day 23） of air drying and on day 30 of ripening were used as experimental objects. Polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was used to analyzed the microflora. Results showed that Staphylococcus saprophyticus， Macrococcus epidermidis， S. edaphicus， Hafnia paralvei， and Leuconostoc gelidum were the dominant bacteria in all samples. Staphylococcus was the most diverse genus. The two proteases could enrich the microbial species in dry-cured mutton ham. Staphylococcus xylosus appeared on day 30 of maturation for the treatment groups. During the entire process， the microflora remained relatively stable and was little affected by the two proteases.

Keywords： dry-cured mutton ham; zingibain; actinidin; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis; microfloral change

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010

中图分类号：TS251.53                                   文獻标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）04-0008-05

引文格式：

阿尔祖古丽·阿卜杜外力， 玉素甫·苏来曼， 巴吐尔·阿不力克木. 生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对干腌羊火腿微生物菌相变化的影响[J]. 肉类研究， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010.    http：//www.rlyj.net.cnAerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU. Effect of zingibain and actinidin on microfloral changes during processing and ripening of dry-cured mutton ham[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010.    http：//www.rlyj.net.cn变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是1979年由Fischer[1]、Lerman[2]等提出的一种分离微生物的凝胶电泳技术[3-4]。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是在传统微生物技术基础上扩增rDNA或rRNA，从而用于分子鉴定，并在微生物多样性研究方面得到良好应用的一种技术[5-6]。PCR-DGGE技术的原理是从样品中直接提取细菌总DNA，进行PCR扩增，并将DNA分子双螺旋结构通过梯度分布的不同质量浓度聚丙烯酰胺凝胶进行解链，随解链程度的增加，其迁移率逐渐减小，从而将DNA（长度相同但碱基序列不同）分离[7]。相对于传统微生物分离鉴定方法，PCR-DGGE技术具有经济快速、可靠性强、重现性好、方便快捷等优点[8]。

PCR-DGGE技术在肉制品中主要用于研究新疆熏马肠[9]、风干羊肉[10]、热鲜肉[11]、冷鲜羊肉[12]、气调包装切片熟肉制品[13]、真空包装牛肉[14]、冷却牛肉[15]、低温贮藏猪肉[16]、真空包装烟熏火腿切片[17]、鱼类[18]、冰鲜鸡[19]、盐水鹅[20]等的微生物菌相变化。

本研究采用PCR-DGGE技术研究生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对干腌羊火腿菌相变化的影响，为外源植物蛋白酶在干腌羊火腿中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆绵羊鲜后腿 乌鲁木齐沙依巴克区和田街农贸市场牛羊肉配送中心。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg）、猕猴桃蛋白酶（酶活力≥500 U/mg） 上海鼓臣生物技术有限公司;

细菌基因组DNA提取试剂盒、Go Taq Green Master Mix、Tris-碱、丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N-甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、琼脂糖、尿素、四甲基乙二胺、Na2EDTA·2H2O 天根生化科技公司;Marker 东胜生物科技有限公司;乙醇（体积分数75%、95%）、硝酸银、冰乙酸、无水碳酸钠、氢氧化钠、甲醛 康济药械有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;Avanti-J-26S XPI落地式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司;

SWC7-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;INGENYphorU-2 DGGE电泳仪、C1000 PCR扩增仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿加工工艺

工艺流程：新鲜羊后腿→冷却修整→低温腌制→浸泡洗腿→吊挂风干→成熟→成品

工艺条件：参考阿尔祖古丽·阿卜杜外力等[21]的方法。

1.3.2 取样

以羊腿股二头肌为采样点，分别设置生姜蛋白酶添加量0.05%（占原料肉的质量分数，下同）处理组（S组）、猕猴桃蛋白酶添加量0.05%处理组（M组）和对照组，分别于风干前期（8 d）、风干中期（15 d）、风干后期（23 d）、成熟期（30 d）工艺点及鲜羊腿（0 d）、腌制（3 d）阶段取样，置于-20 ℃冷冻保藏，用于微生物菌相测定。蛋白酶均为腌制（3 d）结束后添加。

1.3.3 细菌总DNA提取

参考Golowczyc等[22]的方法，并稍作修改。在无菌条件下称取15 g肉样，剪碎，将肉样放入200 mL锥形瓶中，加入150 mL生理盐水，在摇床上37 ℃条件下振摇40 min，结束后静置10 min，取上层液体转移到灭菌的50 mL离心管中，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，吸取上清液转移至新的灭菌离心管中，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取沉淀于2 mL灭菌的离心管中;根据细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取细菌总DNA，提取结束后将其溶于50～100 μL试剂盒所带TE缓冲液（由Tris和乙二胺四乙酸配制而成）中，用琼脂糖电泳进行检验，如450～500 bp处有条带说明DNA提取成功，将细菌总DNA在-20 ℃条件下保存，用于PCR扩增。

1.3.4 PCR扩增

对提取的细菌总DNA 16S rDNA的V6～V8区片段进行PCR扩增，选用引物序列[23-24]：上游引物带GC夹子的U968为5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3、下游引物L1401为5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，以上引物均由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。

PCR反应体系（25 μL）：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR扩增程序[25]：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30 個循环;72 ℃延伸2 min。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如有明亮条带出现，说明DNA提取并扩增成功，将PCR产物在-20 ℃条件下冷冻保存，用于DGGE分析。

1.3.5 DGGE分析

对细菌16S rDNA的V6～V8区片段扩增产物进行DGGE分析：按照韩鲜娜[26]的方法进行制胶;用蠕动泵将高质量浓度和低质量浓度胶灌进DGGE制胶玻璃板，凝固后再用医用无菌注射器灌浓缩胶，完全凝固后将制胶装置放入装有3/5电泳缓冲液的电泳槽内，先在200 V电压下预电泳10 min，随后在90 V电压下电泳16 h[27]。

电泳结束后，按照韩鲜娜[26]的方法，取出胶片置于干净的不锈钢容器中，倒入250 mL 1×固定液，振摇3 min;倒掉固定液，再加入250 mL银染溶液，振摇15 min;倒掉银染溶液，用去离子水对凝胶和容器进行清洗后，倒入250 mL去离子水，振摇2 min;倒掉去离子水，加入显色液，振摇至出现清晰条带为止;弃去显色液，加入250 mL 1×固定液，振摇5 min;弃去固定液，进行照相和割胶。

1.3.6 DNA回收、纯化、测序

DNA回收：将染色后的DGGE胶片置于白光板上，用无菌手术刀切下DGGE胶上不同位置的条带，分别放入1.5 mL灭菌离心管中，再加入20 μL蒸馏水，置于4 ℃条件下过夜。

DNA测序：以回收的DNA为模板，取2 μL进行16S rDNA V6～V8区域的扩增，上游引物U968为5-AACGCGAAGAACCTTAC-3，下游引物L1401为5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，PCR扩增方法同1.3.4节。扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳检验，在450～500 bp处有明亮条带出现可以证明该回收DNA的存在，然后将剩余PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

测序后获得16S rDNA基因片段序列，通过NCBI中的BLAST将所得序列与数据库中已知序列进行相似性比对。

2 结果与分析

2.1 干腌羊火腿细菌总DNA提取结果

S. 0.05%生姜蛋白酶处理组;M. 0.05%猕猴桃蛋白酶处理组。下同。

采用DNA提取试剂盒在无菌条件下从不同干腌羊火腿中提取细菌总DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测。由图1可知，各组样品均得到明亮条带，说明提取方法得当，提取效果良好，可以进行后续实验。

2.2 细菌16S rDNA V6～V8可变区PCR扩增结果

以干腌羊火腿细菌总DNA为模板，用引物对

16S rDNA V6～V8可变区进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得约450～500 bp的特异性片段。由

图2可知，各组样品均有明亮的扩增条带出现，说明本研究的PCR扩增条件合适，得到的PCR扩增产物可以进行后续DGGE分析。

2.3 干腌羊火腿中微生物DGGE图谱主要条带序列分析

由图3可知，同一泳道、不同位置的条带代表不同的微生物。选择DGGE图谱中的条带进行割胶、测序，登录NCBI用BLAST在GenBank数据库与已知序列进行相似性分析，所测序列大小均为415 bp左右，分析结果如表1所示。结合图3和表1分析可知，表皮巨球菌（条带4）、腐生葡萄球菌（条带8）、土壤葡萄球菌（条带9）、哈夫尼亚菌（条带12）、明串珠菌（条带14）等为各组干腌羊火腿加工过程中的主要优势菌，并均存在于各组干腌羊火腿加工的各阶段。腐生葡萄球菌（条带1和2）、表皮巨球菌（条带3）、条带5、琥珀葡萄球菌（条带6）也存在于干腌羊火腿加工过程中的各个阶段，但条带较暗。腐生葡萄球菌（条带7）主要存在于猕猴桃蛋白酶处理组，木糖葡萄球菌（条带11）主要存在于生姜蛋白酶处理组成熟期（S组30 d）和猕猴桃蛋白酶处理组成熟期（M组30 d）。明串珠菌（条带13）存在于各取样阶段，但猕猴桃蛋白酶处理组成熟期条带颜色最深。明串珠菌（条带10和15）均存在于加工过程，但条带较细。条带16存在于各加工阶段，对照组23 d和M组30 d条带最为明显，但测序失败。Allobranchiibius huperziae（条带17）存在于各加工阶段。

3 讨 论

目前利用PCR-DGGE法检测肉制品中微生物的研究较多，且主要集中在发酵香肠的微生物区系、香肠成熟过程中微生物种群的动态变化研究等方面。采用PCR-DGGE法对各阶段干腌羊火腿中微生物菌相变化进行研究，结果表明，整体来说，各组干腌羊火腿细菌多样性较为丰富。

微生物在干腌火腿风干成熟过程中的作用不可忽视。大量研究表明，乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌等是火腿和发酵香肠等传统腌制肉制品中的常见微生物。干腌羊火腿的微生物主要来自于腌制以及风干过程中表面微生物的入侵。本研究结果表明，葡萄球菌、明串珠菌、表皮巨球菌、哈夫尼亚菌是干腌羊火腿的优势菌，其中葡萄球菌的种类较其他菌种多。张波等[10]对风干羊肉的挥发性风味物质进行研究得出，葡萄球菌为优势菌种;黄艾祥[28]对云南牛肉干巴和云南干腌火腿进行研究得出同样的结果。肉制品中生长的乳酸菌和葡萄球菌可以分解肉中的蛋白质，并有助于产生大量风味物质，从而提高产品营养价值[29-30]。本研究中，各组干腌羊火腿加工前期和后期的微生物组成较稳定，原因可能是腌制期温度较低，对火腿内部微生物有抑制作用，在后续风干过程中温度逐步上升，火腿的盐含量也上升，对微生物的生长有抑制作用。

4 结 论

通过PCR-DGGE技术对添加生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的干腌羊火腿微生物菌相变化进行研究，结果表明：腐生葡萄球菌、表皮巨球菌、土壤葡萄球菌、哈夫尼亚菌、明串珠菌是各组干腌羊火腿的优势菌，其中葡萄球菌属种类较多;2 种蛋白酶可丰富干腌羊火腿中微生物的种类，2 种蛋白酶处理组成熟期30 d时均出现木糖葡萄球菌;在整个加工过程中，干腌羊火腿微生物菌相变化较稳定，受2 种蛋白酶的影响不大。

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收稿日期：2020-01-13

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31260381）

第一作者简介：阿尔祖古丽·阿卜杜外力（1992—）（ORCID： 0000-0001-7367-5699），女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail： 17699336132@163.com

通信作者简介：巴吐尔·阿不力克木（1968—）（ORCID： 0000-0002-6873-9632），男，教授，博士，研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail： batur6805@126.com