风干肠加工和贮藏过程中蛋白质的降解规律

牛树彬　田婧　周慧敏　朱子冬　周桓宇　闫欢　张顺亮

摘 要：以總氮、非蛋白氮、氨基酸态氮、挥发性盐基氮、游离氨基酸以及不同种类蛋白质（肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、碱溶蛋白和碱不溶蛋白）为指标，分析研究风干肠加工和贮藏过程中蛋白质的降解规律。结果表明：风干肠加工和贮藏过程中总氮含量没有显著变化;非蛋白氮含量持续升高，从原料肉的469.4 mg/100 g增加到成品肠的786.4 mg/100 g，贮藏240 d后增加至1 256.1 mg/100 g;多肽氮和氨基酸态氮含量在加工和贮藏过程中均持续增加，挥发性盐基氮含量在风干过程中没有显著变化，在贮藏180 d后迅速增加;大部分游离氨基酸含量经过加工和贮藏均有所提高，只有半胱氨酸含量明显降低;在加工过程中，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量均因降解而减少，基质蛋白含量明显增加;在贮藏过程中，肌浆蛋白含量持续降低，肌原纤维蛋白含量在贮藏前180 d无明显变化，贮藏至240 d明显减少，基质蛋白含量没有显著变化。

关键词：风干肠;加工;贮藏;蛋白质组分;动态变化;降解规律

Pattern of Proteolysis in Air-Dried Sausages during Processing and Storage

NIU Shubin1， TIAN Jing1， ZHOU Huimin2， ZHU Zidong1， ZHOU Huanyu1， YAN Huan1， ZHANG Shunliang2，*

（1.The Experimental Teaching Center of Traditional Chinese Medicine and Biotechnology， Beijing City University， Beijing 100094， China;

2.Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： The pattern of proteolysis in air-dried sausages during processing and storage was analyzed by the detection of total nitrogen （TN）， non-protein nitrogen （NPN）， amino acid nitrogen （AAN）， total volatile basic nitrogen （TVB-N）， free amino acids （FAA）， and various proteins （sarcoplasmin， myofibrillar protein， alkali-soluble protein and alkali-insoluble protein）. The results showed that the TN content did not change significantly during processing and storage. The NPN content increased from 469.4 mg/100 g in raw meat to 786.4 mg/100 g in sausages， and then to 1 256.1 mg/100 g after 240 days of storage. The contents of peptide nitrogen and AAN continued to increase during processing and storage. The content of TVB-N did not change significantly during the air-drying process， but increased rapidly after 180 days of storage. The contents of most of the FAA in raw meat increased after being processed into sausages and gradually increased during storage， while only cysteine content reduced significantly. During processing， both the contents of sarcoplasmic and myofibrillar proteins decreased due to degradation， while the content of matrix protein significantly rose. During the storage process， the content of sarcoplasmic protein continued to decrease， while the content of myofibrillar proteins showed no significant change in the first 180 days and decreased significantly on day 240， and the content of matrix proteins showed no significant change over the entire storage period.

Keywords： air-dried sausages; processing; storage; protein components; dynamic change; degradation pattern

（1）

1.3.3 蛋白质组分的分离

参考孙为正[13]的方法。按照1.3.1节所述取样方法称取样品5 g，加入50 mL溶液A（含15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），用匀浆机10 000 r/min匀浆1 min，匀浆液在冷冻离心机中离心（5 000×g、4 ℃、15 min），此提取过程重复操作2 次。上清液处理：加入50 g/100 mL三氯乙酸使上清液三氯乙酸质量浓度达到10 g/100 mL，使用冷冻离心机5 000×g、4 ℃离心15 min，上清液部分为非蛋白氮，沉淀部分为肌浆蛋白。沉淀部分加入10 倍体积溶液B（含0.45 mol/L KCl、15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L

KH2PO4，pH 7.5），于匀浆机中12 000 r/min匀浆，匀浆液在5 000×g、4 ℃条件下离心15 min，重复提取过程2 次，合并上清液得盐溶部分，即肌原纤维蛋白，沉淀部分为总基质蛋白。总基质蛋白再用10 倍体积0.1 mol/L NaOH连续搅拌提取8 h，5 000×g、4 ℃离心15 min，上清液为碱溶蛋白，沉淀为碱不溶蛋白。

1.3.4 蛋白质组分含量测定

采用凯氏定氮法，参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》并略作修改。

1.3.5 非蛋白氮含量测定

采用凯氏定氮法，按照1.3.1节所述方法准确称取样品2 g，加入40 mL 10 g/100 mL三氯乙酸，摇床振荡30 min，过滤并用少量10 g/100 mL三氯乙酸洗涤沉淀。收集滤液后用10 g/100 mL三氯乙酸定容到100 mL，取20 mL进行消化、定氮。同时进行不加样品的空白对照实验。

1.3.6 挥发性盐基氮含量测定

采用自动凯氏定氮仪法，按照1.3.1节取样方法称取样品10 g，具体参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.3.7 氨基酸态氮含量测定

采用酸度计法，按照1.3.1节取样方法称取样品5 g，具体参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》进行测定。

1.3.8 多肽氮含量测定

多肽的提取参照胡亚亚[14]的方法。取样品25 g，绞碎后加入100 mL pH 7.0磷酸缓冲液，冰浴匀漿4 次（22 000 r/min，每次10 s）;匀浆液于4 ℃条件下静置2 h后离心（4 ℃、12 000×g、20 min），取上清液加入3 倍体积分数40%乙醇，放置12 h后再次离心（4 ℃、12 000×g、20 min），所得上清液用1 mol/L NaOH调节至pH 7.0;上清液经冷冻干燥后置于-20 ℃保存备用。多肽含量测定参考方细娟[15]的方法。

1.3.9 游离氨基酸含量测定

参考张顺亮等[16]的方法，按照1.3.1节取样方法准确称取样品5 g，加入去离子水40 mL，静置30 min后，加入10 g/100 mL磺基水杨酸混合均匀，于4 ℃条件下放置17 h，用0.2 μm微孔滤膜过滤，采用全自动氨基酸分析仪测定，主要参数：阳离子交换树脂（4.6 mm×60 mm）;自带配套缓冲液;流速

0.4 mL/min;加热温度135 ℃;等光程凹面衍射光栅分光光度计检测，检测波长为440 nm和570 nm;EZChrom Elite for Hitachi AAA控制。具体参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

1.3.10 蛋白质水解指数计算

非蛋白氮含量占总氮含量的比例即为蛋白质水解指数，按式（2）计算。

（2）

1.3.11 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

采用12%分离胶、6%浓缩胶。取样品40 μL与10 μL 5×Loading Buffer混合后煮沸10 min，上样量20 μL，电泳条件为30 mA恒流。电泳结束后采用考马斯亮蓝染色1 h，去离子水脱色1 h，重复脱色3 次。采用荧光化学发光凝胶成像系统拍照。

1.4 数据处理

称取的肉质量按1.3.2节公式换算成干基质量。所有实验平行测定3 次，测定结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 22软件Duncans检验进行组间数据的差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 风干肠加工和贮藏过程中非蛋白氮的变化

2.1.1 非蛋白氮含量变化

总氮含量是风干肠中所含全部氮的含量，包括非蛋白氮和蛋白氮，蛋白质水解指数是非蛋白氮含量占总氮含量的比例，可以反映风干肠加工和贮藏过程中蛋白质降解的总体趋势。

由表1可知，在风干肠的加工过程中，总氮含量（以干基计）略有波动，但变化不显著，即加工过程对总氮含量影响不大。非蛋白氮含量从原料肉中的469.4 mg/100 g增加到成品风干肠中的786.4 mg/100 g，蛋白质水解指数由8.44%增加到14.52%，整体呈上升趋势，这主要是由蛋白质降解造成的，与烘烤法和日晒法生产的广式腊肠变化规律均相似[12]。

由表2可知，采用真空包装、25 ℃贮藏的风干肠贮藏过程中非蛋白氮含量依然持续升高，从成品肠的786.4 mg/100 g增加到贮藏240 d的1 256.1 mg/100 g，蛋白质降解指数从14.52%增加到22.97%。由于真空包装能够有效抑制好氧微生物的生长，风干肠中蛋白质的降解可能主要是由肌肉组织中的组织蛋白酶、二肽酶和氨肽酶等酶的作用引起的[13]。国外研究表明，干腌火腿和干腌香肠成熟过程中，在组织蛋白酶、钙蛋白酶和氨基态酶等酶的作用下非蛋白氮含量会持续升高[17-18]。赵改名[19]研究表明，金华火腿中的蛋白质也会在组织蛋白酶、二肽酶和氨肽酶的作用下持续降解。另外，真空包装下厌氧微生物的滋生也可能是贮藏期非蛋白氮含量升高的原因[12]。

2.1.2 非蛋白氮组成变化

腌腊肉制品中的非蛋白氮包括多肽氮、氨基酸态氮、挥发性盐基氮、核酸氮和其他含氮化合物等，其中最主要的是多肽氮、氨基酸态氮和挥发性盐基氮。对金华火腿的研究表明，这3 种形式的氮占金华火腿非蛋白氮的65%左右[20]。蛋白質首先由组织蛋白酶、钙蛋白酶和二肽酶降解生成小分子肽，再由氨基态酶降解生成游离氨基酸，大量氨基酸再通过Strecker降解和美拉德反应形成酮、醛、酸、醇、酯、吡嗪和含硫化合物等挥发性风味物质[21]。因此，多肽氮和氨基酸态氮含量在蛋白质降解过程中处于动态变化中。

由表3可知，风干肠加工过程中多肽氮含量持续升高，从原料肉的68.8 mg/100 g增加到成品肠的256.5 mg/100 g，这是由内源组织蛋白酶活跃引起的，或者是由于好氧微生物滋生产生的外源肽酶的作用[22]。氨基酸态氮含量在风干肠加工过程中也呈升高趋势，但是在风干3 d后增加不显著，一方面是由于氨基酸底物增多导致Strecker降解和美拉德反应加速，另一方面可能是由于风干肠风干后缺水造成微生物活跃程度下降所致。挥发性盐基氮含量不但可以用来评价肉制品风味，也是衡量肉制品腐败变质的指标，不同类型肉制品中其含量也有差异[13，23]。风干肠中挥发性盐基氮含量在加工初期的腌制和烘干阶段明显提高，进入风干期后无明显变化，成品肠中含量为15.9 mg/100 g，与广式腊肠中挥发性盐基氮含量相似[12]，与发酵火腿相比则相差较大[22]。

由表4可知，风干肠贮藏过程中多肽氮含量在贮藏初期增长较为缓慢，贮藏60 d和120 d差异不显著，但贮藏后期显著增加，这是由于在贮藏初期，真空包装抑制了好氧微生物的生长，从而阻止了蛋白质降解。贮藏后期厌氧微生物生长加速，导致蛋白质的快速降解。氨基酸态氮和挥发性盐基氮含量在整个贮藏过程中均持续升高，氨基酸态氮含量升高速率比较稳定，挥发性盐基氮含量升高速率逐渐加快，贮藏初期（60 d）挥发性盐基氮含量提高6.87 mg/100 g，贮藏120 d时比贮藏60 d时又提高5.8 mg/100 g，贮藏180 d时为35.69 mg/100 g，与广式腊肠研究结果相似[12]，贮藏240 d时提高到47.29 mg/100 g。

2.1.3 游离氨基酸组成变化

游离氨基酸是决定腌腊肉制品风味的重要组分，不同产品中呈味氨基酸含量不同[13，24]。由表5可知，风干肠加工过程中游离氨基酸含量整体呈上升趋势，从原料肉的415.28 mg/100 g增加到成品肠的911.44 mg/100 g。除天冬氨酸、半胱氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸外，其他氨基酸含量均大幅度提高，特别是其中对腌腊肉制品风味产生重要影响的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸含量增加极为显著[25]，6 种氨基酸总量提高2.4 倍，这与广式腊肠中的变化相似[12]。风干肠加工过程中天冬氨酸和和羟脯氨酸含量无明显变化，半胱氨酸和脯氨酸含量呈先上升后下降的趋势，尤其是半胱氨酸，在风干3 d时含量为58.89 mg/100 g，但在风干6 d真空包装后骤然降至0.03 mg/100 g。

由表6可知，风干肠贮藏过程中游离氨基酸含量依然呈显著上升趋势。鲜味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量分别提高11.4、2.9、1.6、2.3 倍，其他对腌腊肉制品风味影响较大的氨基酸，除酪氨酸含量降低以外，亮氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸含量分别提高2.06、2.34、1.47 倍。

2.2 风干肠加工和贮藏过程中蛋白氮的变化

2.2.1 蛋白质组成变化

由表7可知，基质蛋白是风干肠中蛋白的主要成分，在加工过程中含量整体呈上升趋势，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量在风干3 d前均呈降低趋势，造成这一现象的主要原因有2 个：一是加热导致肌浆蛋白和肌原纤维蛋白部分变性，从而转化成基质蛋白;二是肌原纤维蛋白和肌浆蛋白降解产生氨基酸和肽。这一结果与广式腊肠[14]和宣恩火腿[23]的研究结果一致。但是风干3 d后到成品肠的制作工程中3 种蛋白含量无显著变化，一方面是由于后续的加工过程中没有加热过程，另一方面是由于风干后水分含量降低，导致蛋白降解的微生物活性和酶活性降低[26]。

由表8可知，风干肠贮藏过程中，肌浆蛋白含量呈下降趋势，但下降速率较慢，贮藏120 d时才观察到显著降低。贮藏至240 d时，风干肠肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量均明显下降，这是由于蛋白酶的持续作用导致蛋白质降解的蓄积所致。在贮藏240 d内，基质蛋白含量的变化不显著。

2.2.2 蛋白质电泳分析

肌浆蛋白主要由磷酸化酶、肌酸激酶、磷酸激酶或磷酸丙糖异构酶等构成[26]。由图1A可知：风干肠加工过程中肌浆蛋白中大分子质量蛋白（97.2 kDa）含量呈递减趋势，小分子质量蛋白（60 kDa左右）含量则有所增加;贮藏60 d时，分子质量66.4 kDa以上的蛋白几乎全部降解，贮藏到240 d时分子质量60 kDa左右的蛋白发生降解，分子质量44 kDa左右的蛋白增加，说明在加工和贮藏阶段引起肌浆蛋白降解的蛋白酶不同。肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白等[27]。由图1B可知，在风干肠加工过程中肌原纤维蛋白含量无明显变化。在贮藏阶段，分子质量66.4 kDa以上的大分子蛋白大量降解，分子质量66.4 kDa以下的蛋白无明显变化。碱溶蛋白主要由肌浆蛋白和肌原纤维蛋白转化而来。由图1C可知，在风干肠加工进程中碱溶蛋白含量增加，在贮藏期碱溶蛋白的变化不明显，但是分子质量97.2 kDa以上的蛋白明显降解，与肌浆蛋白和肌原纤维蛋白变化相似。碱不溶蛋白主要包括胶原蛋白、弹性蛋白和网状蛋白。由图1D可知，碱不溶蛋白主要是大分子质量蛋白，在整个加工和贮藏过程中变化都不大。

3 结 论

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DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.07.039.

收稿日期：2020-02-03

基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2017YFD0400105）

第一作者简介：牛树彬（1982—）（ORCID： 0000-0003-1694-2513），男，副教授，博士，研究方向为食品加工与安全。

E-mail： niushubin0704@163.com

通信作者简介：张顺亮（1985—）（ORCID： 0000-0001-5810-8653），男，高级工程师，硕士，研究方向为畜产品加工。

E-mail： 270157988@qq.com