附子不同炮制品对阳虚小鼠免疫功能的影响

沈玉巧，林 华*，邓广海，陈丹丹，刘瑶玉，周 威

(1.广东省中医院 药学部，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510380)

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品，具有回阳救逆、散寒止痛之功效[1]。附子中的主要化学成分为生物碱，此外还含有多糖、黄酮类、皂苷类、植物甾醇等。其中附子多糖不仅能增强细胞免疫还能增强体液免疫，在抗肿瘤、抗氧化等方面均有较好的作用[2]。附子的传统炮制工艺往往以减毒为主，因此常有炮制品的毒性虽然很小，但有效成分含量偏低的现象[2]，发挥不了功效。本实验对比了高温、高压、微波三种新型炮制工艺，结合传统炮制工艺，对炮制品煎煮液的6种主要单双酯型生物碱含量进行了测定[1]，同时对4种炮制品对于阳虚小鼠免疫器官的影响进行比较，为附子新型炮制工艺的推广与应用提供药理学基础。

1 材料与设备

1.1 动物

实验所用动物均为SPF级 KM种小鼠，雌、雄各半，体质量约20 g，由广东省医学实验动物中心提供(小鼠合格证号：44007200012065)。

1.2 仪器与试药

AUY220型分析天平(日本岛津)、Agilent-1200型HPLC、RV 10basic V旋转蒸发仪(IKA)。附子药材(批号：20130812，产地：四川江油)由康美药业四川江油分公司提供，经广东省中医院药剂科主任中药师鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根；微波炮制品、黑顺片、高温炮制品、高压炮制品均由实验室按照统一标准条件通过同一批原药材制得。乙腈、四氢呋喃为色谱级纯；注射用氢化可的松琥珀酸钠(批号：201308011，烟台北方制药有限公司)；水合氯醛为分析纯。

2 方法

2.1 炮制工艺

2.1.1 黑顺片[1]按照药典要求进行炮制。

2.1.2 高压炮制片[4]取附子生品2 kg，洗净后喷洒胆巴水适量，盖上用胆巴水沾湿的湿布闷润30 min，设置压力为0.1 MPa蒸制150 min，切薄片于50 ℃烘干去除碎屑即得。

2.1.3 高温烘制片[5]取附子生品2 kg，每天按时更换胆巴水，泡至内无白心，切薄片于烘箱120 ℃烘制12 h，去除碎屑即得。

2.1.4 微波炮制片[6]取附子生品2 kg，喷洒胆巴水适量，盖上用胆巴水沾湿的湿布至透心，切薄片放入格兰仕微波炉中，中火炮制25 min即得。

2.2 煎煮液的制备及含量测定

取附子各炮制品1 000 g加入陶瓷煎锅中，先加10倍量水浸泡30 min后，武火至沸，再文火煎煮1 h，过滤，药渣加8倍量的水煮沸后再煎煮30 min，合并2次煎煮液。真空减压加热浓缩至0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg；置于冰箱冷藏室保存。取煎煮液各10 mL，以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液置椭圆形旋转烧瓶中，40 ℃减压回收溶剂至干，向瓶中加入盐酸-甲醇(0.05%)溶液2 mL溶解，过0.45 μm微孔滤膜即得。通过HPLC测得生品及炮制品以及炮制品煎煮液的生物碱含量。

2.3 对阳虚小鼠免疫器官的影响

取合格的SPF级KM小鼠，雌雄各半，随机分为模型组、空白组、4种炮制品组(包括0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg三种浓度)，共14组，每组8只。参照文献方法[7]，模型组及各给药组小鼠每日灌胃给予氢化可的松琥珀酸钠溶液1 mg/只/天，空白组小鼠每日给予同体积生理盐水，连续造模9天。第10天开始，空白组和模型组灌胃给予蒸馏水0.2 mL/10 g，给药组按照附子不同炮制品给药剂量0.2 mL/10g进行灌胃给药，连续给药6天。于第11、13、15天灌胃给药后，给药组及模型组继续给予造模给药。于第1、5、9、10、12、15天对各组小鼠进行称重。末次给药后24 h，断头处死。立即取各组小鼠的脾脏、胸腺，0.9%的生理盐水漂洗干净，滤纸吸干后称重，计算脾脏、胸腺的质量指数。

2.4 结果统计

实验数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析。

3 结果

3.1 附子生品及不同炮制品生物碱含量

测得附子生品和4种炮制品以及4种炮制品煎煮液的主要生物碱含量见表1、表2。由表1及表2可知，附子高压炮制品及其煎煮液的单酯型生物碱含量最高，双酯型生物碱含量最低；炮制品生物碱含量均在2015版药典的限量范围内。

表1 附子生品及不同炮制品生物碱含量 (mg/g)

注：“-”代表未检出，计算时按“0.000 0”计。

表2 附子不同炮制品煎煮液的生物碱含量 (mg/g)

注：“-”代表未检出，计算时按“0.000 0”计。

3.2 各组小鼠体质量随时间变化趋势

通过SPSS 20.0软件统计分析发现，造模9天后模型组及各给药组小鼠体质量与空白组小鼠体质量比较存在统计学差异(P<0.05)，说明本次实验造模是成功的。由图1、图2、图3四种炮制品的高、中、低三种给药浓度的体质量增长趋势图可知，4种给药组小鼠体质量增加幅度均较模型组变大，但无明显差异(P>0.05)；同时高压片组的体质量增长幅度略高于其他3组。

图1 小鼠体质量变化趋势(0.75 g/kg剂量组)

图2 小鼠体质量变化趋势(1.50 g/kg剂量组)

图3 小鼠体质量变化趋势(4.50 g/kg剂量组)

3.3 附子不同炮制品对阳虚小鼠免疫器官的影响

组别剂量(g/kg)胸腺指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)空白-3.7189±1.3568∗2.2194±0.2807∗模型-1.5649±0.16341.2653±0.1351高温片组高压片组微波片组黑顺片组高温片组高压片组微波片组黑顺片组高温片组高压片组微波片组黑顺片组0.751.504.501.9269±0.40661.9238±0.35111.7130±0.18992.1016±0.48972.3211±0.4929∗2.2242±0.2788∗1.9044±0.13612.3065±0.5675∗2.6364±0.6458∗2.8701±0.9905∗2.3092±0.5118∗2.7738±1.0111∗1.3424±0.07221.3613±0.19581.3111±0.10511.3940±0.18761.4509±0.0503∗1.5083±0.1611∗1.4967±0.1626∗1.4567±0.1848∗1.6448±0.1719∗1.7345±0.1511∗1.6188±0.1518∗1.6679±0.2329∗

由表3可知，模型组与空白组相比，小鼠的胸腺及脾脏指数出现较大幅度的下降(P<0.05)；与模型组相比，随着给药浓度的增加，附子4种炮制品组脾脏指数及胸腺指数较模型组均有所增加。同时在给药浓度为4.50 g/kg时，各炮制品组与模型组相比存在显著性差异(P<0.05)，说明附子炮制品均能提高阳虚小鼠的免疫器官质量指数；且随着给药浓度的增加，对免疫功能的提高作用成正相关，脏器指数的增加能够反映免疫功能的提高[8]。附子4种炮制品组在相同给药浓度的条件下，对阳虚小鼠免疫器官质量指数的提高无统计学差异(P>0.05)。

4 讨论

附子传统的炮制工艺为了降低毒副作用，首先要通过长时间的胆巴水浸泡、再通过蒸煮等方法进行炮制加工，毒副作用降低的同时生物碱类成分损失严重，而且炮制过程复杂耗时。本文通过对高温烘制、高压蒸制、微波炮制与传统炮制的附子进行比较研究，发现高压蒸制片的生物碱能够得到较好的保存，同时对阳虚小鼠的体质量及免疫功能的提高也较好。至于高压蒸制工艺能否取代传统炮制工艺还需进一步的实验支持与完善。