新型冠状病毒疫情期口腔患者细菌培养标本的检验策略

周莉娜 黄萍 任鸿艳

目前，新型冠状病毒感染的肺炎已成为全球公共卫生高风险事件。有文献报道的COVID-19无症状感染者，还有偶见超长的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)潜伏期[1-2]等，对于口腔疾病患者尤其是急诊手术患者，因为无法在第一时间鉴别，所以给临床治疗及其口腔标本的细菌培养工作带来潜在感染风险[3]。口腔疾病患者极有可能成为潜在的传染源，其急性感染期的脓液、痰液和分泌物等标本，具有潜在的病毒生物安全危害。同时为了治疗细菌感染性口腔疾病，不得不依据细菌培养而明确致病菌及获得抗菌药物敏感性等信息。这就让临床微生物实验室细菌培养的工作面临更大的挑战[4]。

截至2020年2月23日，新型冠状病毒实验室生物安全试行版已经发布第二版，将新型冠状病毒暂定为病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物，对各级、各类检验实验室提出了明确的生物安全防护和生物安全管理要求[5-6]。

临床标本的细菌培养检验不同于常规血液标本等检验，也不同于分子生物学的PCR核酸检测。核酸检测标本在检测之前都会经过灭活处理[7]，而进行细菌培养的标本不能进行灭活，因灭活病毒的同时细菌的活力也要受影响，会将本应培养阳性的标本变为培养阴性;同时因细菌培养步骤繁多，涉及检验人员大量的手工操作，培养过程中培养箱内存在产生高浓度气溶胶的风险[8-9]，让临床细菌培养的工作处在一个高风险岗位。口腔专科医院的临床微生物室大部分的培养标本来自于口腔，特殊岗位和特殊时期，在医院疫情防控领导小组的部署下，结合《口腔医院对新型冠状病毒防控的要点》(试行)，将所有临床上需要细菌培养的标本，视为生物安全高风险标本[10-11]，这就对操作流程和生物安全规范提出了更高的要求。该文对临床微生物实验室的应对策略作一梳理，以更好地阻断潜在的新型冠状病毒的传播和降低实验室工作风险。

1 检验前质量控制

在医院下达应对新型冠状病毒肺炎通知的第一时间，迅速沟通各临床科室标本运送人员，在做好个人防护基础上，进一步按照规范护送临床标本。

1.1 细菌培养标本的院内转运

标本从临床到实验室，采用专人专送，转运步骤如下：①送检人员需按照一级生物安全及以上防护，戴医用外科口罩、医用防护帽、乳胶手套、穿工作服，送之前和送之后做手卫生;②临床医生将患者口腔的脓液、痰液、分泌物等标本，采集于密闭针筒、密闭拭子、带螺纹的密闭无菌杯等，运送人员将标本装入有明确标识的标本转运专用密封盒，装盒之前75%酒精或含有效氯1 000 mg/L消毒剂[12]擦拭消毒运送盒内、外表面，晾干备用，盖好运送盒盖子后，再次消毒标本转运盒的外表面，然后做手卫生;③标本从临床科室运送至临床微生物实验室途中，运送人员禁止打开转运盒盖，运送时尽量保持平稳，避免震荡和颠簸;④到达临床微生物实验室后，运送人员将标本放入标本接收专用单向传递窗，关好传递窗门，用传递窗边的含酒精免洗手消毒液做手卫生后方可离开。

1.2 标本的接收登记

实验室需严格分区，从外到内依次分为清洁区、缓冲区、半污染区和污染区，各区标识醒目，分工明确，空间分布清晰合理。标本通道和工作人员通道严格区分，形成闭合回路，适应微生物检验的实验室生物安全需要。

积极培训检验人员COVID-19相关实验室防护知识，进入实验室必须按照二级生物安全防护[13-14]，并在此基础上加强。如怀疑标本有溢漏时，升级为三级生物安全防护，同时用含有效氯浓度5 000～10 000 mg/L[15]的消毒剂，对溢洒台面或地面用毛巾覆盖浸泡消毒30 min以上，再做清洁处理。注意禁止配戴饰物，不留长指甲，以防刮破手套而无察觉。整个操作过程中避免交谈，严格规范进行实验操作。

标本到达实验室后，检验人员首先打开传递窗紫外灯对标本容器外表面及其上条形码进行照射消毒至少30 min。

打开生物安全柜，确保其达到合格的压力值、风流值并平稳运行30 min以上再处理标本，同时在安全柜中备用干净手套，每次操作后，都将外层污染手套更换成干净手套，再移出双手做其他操作，具体操作流程见图 1。

图 1 培养罐(培养盒)在生物安全柜中的操作流程图

Fig 1 Flow chart of operation of culture tank in biological safety cabin

打开传递窗，用75%酒精喷洒传递窗内表面及标本容器外表面，同时取出标本放置于生物安全柜中，关闭传递窗门。

登陆检验信息系统，将标本条码扫描录入LIS系统，在标本接收登记本上做好标本信息登记。

2 检验中质量控制

标本接收后的操作是控制实验室生物安全尤其是实验室气溶胶风险的关键。

在生物安全柜中按照规范的操作接种培养基之后，将传统以培养箱为平板培养空间单位的放置模式，改变为以培养罐(培养盒)为单位放置，把大的培养单位划小，再把培养罐(培养盒)放入培养箱。把原来大的空间划分为一个个培养罐(培养盒)这种小的格局，把大培养变成小培养。按规定的时间培养后，取出培养罐(培养盒)放置于稳定运行的生物安全柜中，此时再打开培养罐(培养盒)盖子取出培养基，做后续检验操作，最大限度降低了潜在病毒的污染和气溶胶传播的可能。

2.1 不使用培养罐(培养盒)培养

原始标本培养只需四步，具体步骤如下:①原始标本容器用75%酒精棉球擦拭消毒容器外表面及开口处;②标本开盖，根据临床申请的细菌培养项目接种相对应的培养基，标本闭盖，再次以75%酒精棉球消毒标本外表面，尤其是盖口处;③在培养基上标识标本信息，更换外层手套，让污染手套留在安全柜中;④将接种好的培养基从生物安全柜中平缓移出放入恒温培养箱中，按规定时间培养。

细菌的传代、分纯、鉴定、药敏的培养也只需四步，具体步骤如下：①从培养箱中取出原始培养基平板，平稳放置于稳定运行的生物安全柜中，并更换手套；②完成原始培养基平板的细菌读取，转种分纯，传代培养，生化鉴定，药敏试验等操作；③更换外层污染手套，让其留在安全柜中；④将培养基平稳转运至培养箱，按规定时间培养。

2.2 使用培养罐(培养盒)培养

接收标本后，原始标本的细菌培养流程详细的操作步骤如图 1：①原始标本容器用75%酒精棉球擦拭消毒容器外表面及开口处；②标本开盖，根据临床申请的细菌培养项目接种相对应的培养基，标本闭盖，再次以75%酒精棉球消毒标本外表面，尤其是盖口处；③在培养基上标识标本信息，轻缓将培养基放入事先消毒好的培养罐(培养盒)中；④分别放入相应的厌氧、微需氧、二氧化碳等产气袋，盖好培养罐(培养盒)盖，再次以75%酒精擦拭消毒培养罐(培养盒)外表面；⑤更换外层手套，让污染手套留在安全柜中；⑥将培养罐(培养盒)从生物安全柜中平缓移出放入恒温培养箱中，按规定时间培养。

细菌的传代、分纯、鉴定、药敏的培养流程，详细的操作步骤如图 1。① 从培养箱中取出装有原始培养基的培养罐(培养盒)，平稳放置于稳定运行的生物安全柜中，并更换手套；② 75%酒精棉球擦拭消毒培养罐(培养盒)外表面及开口处;③ 打开培养罐(培养盒)的盖子，取出培养基放置于生物安全柜台面上;④ 75%酒精擦拭消毒培养罐(培养盒)内、外表面，晾干备用;⑤ 完成原始培养基平板的细菌读取，转种分纯，传代培养，生化鉴定，药敏试验等操作;⑥ 再次将传代、药敏等培养基平板放进消毒后的培养罐(培养盒)，分别放入相对应的厌氧、微需氧、二氧化碳等产气袋，盖好盖子;⑦ 75%酒精擦拭消毒培养罐(培养盒)外表面;⑧ 更换外层污染手套，让其留在安全柜中;⑨ 将培养罐(培养盒)平稳移动至培养箱，按规定时间培养。

2.3 临床常见不同类型细菌培养单位的变化

①厌氧菌的培养：从厌氧箱和混合气的组合方式，变为厌氧罐和厌氧产气袋的组合方式，二者比较见表 1;②嗜二氧化碳菌的培养：从二氧化碳培养箱和二氧化碳气体的组合方式，变为二氧化碳培养罐(培养盒)和二氧化碳产气袋的组合方式，二者的比较见表 2;③需氧菌的培养：从空气培养箱的方式，变为空气培养罐的方式，二者比较见表 3。

表 1 厌氧菌培养不同培养单位比较

表 2 嗜二氧化碳菌培养不同培养单位比较

表 3 需氧菌培养不同培养单位比较

培养箱和培养罐(培养盒)应用广泛，都是经典的细菌培养方法，各有优点，在当前新型肺炎疫情情况下，优化组合使用，可以低风险操作、低风险转运，更好地管控实验室生物安全风险。

2.4 涂片染色流程

需要涂片染色的标本，尽量涂小菌膜，避免涂不必要的大菌膜，生物安全柜中涂片后，紫外灯照射30 min后再用火焰固定，既达到了灭活病毒的目的，又不影响细菌的染色阅片。

3 检验后质量控制

接种后临床标本等感染性废物按照规范就地高压灭菌，严格把控，不让未经灭活的感染性废物出实验室，做到全方位，无遗漏。所有医疗垃圾严格按照医疗废物分类目录分类处理。

接种后原始标本的保存及处理在生物安全柜中，75%酒精擦拭消毒标本容器外表面，干燥后用封口膜封住标本容器开口处，再放入密封塑料袋，收入4 ℃标本保存冰箱暂存。细菌培养后的培养基平板、药物敏感性试验培养基、鉴定培养基、使用后的各种产气袋、实验操作用的一次性手套、帽子、口罩、鞋套等，按照感染性废弃物及时就地高压灭菌，再按照医疗垃圾流程规范移交处理，并做好记录。

分类处理医疗垃圾，细节尤为重要，专用医疗废物收集容器，废物盛放不能过满，不超过容积的3/4，封口紧密严实，标识科室、数量或者重量、和废物类别。分类收集，禁混、禁漏、禁污染。当面清点移交医院医疗垃圾处理部门，记录交接时间。

加强实验仪器和实验室内环境的消毒杀菌管理[15]: ①标本传递窗给每日进行2 次各30 min紫外线消毒杀菌，同时传递窗门及把手用75%酒精擦拭消毒；②恒温恒湿厌氧培养箱，恒温需氧培养箱、二氧化碳培养箱等，将每月1 次的消毒杀菌频率调为每周1 次，增加仪器消毒养护频率；③每天检查生物安全柜的压力值、风速流量是否在正常范围内，且运行平稳。每次使用完毕75%酒精擦拭消毒台面，再紫外灯照射消毒；④废弃物高压灭菌锅，每次使用前检查感染性废弃物压力蒸汽灭菌器的压力值、温度值，使用后做好清洁消毒，每周做好维护保养；⑤菌液浓度比浊仪、加样枪、记录笔、尺子等小物品每次实验结束用75%酒精或含有效氯浓度1 000 mg/L的含氯消毒剂擦拭消毒；⑥每天实验完成做好实验室物体表面分区消毒工作，地面分区保洁工作，严格拖把、抹布分区使用，严防交叉污染；⑦实验室空气每次实验完成用含有效氯浓度1 000 mg/L的含氯消毒剂或者2 g/L过氧乙酸喷洒消毒，每日早晚紫外线消毒1 h，注意消毒期间关闭好门窗并避光；⑧每次完成实验脱实验服前，用含有效氯浓度1 000 mg/L的含氯消毒剂喷洒实验服外表面后再脱下，护目镜放进消毒液1 000 mg/L中浸泡至少30 min，晾干后用75%酒精擦拭消毒，晾干后备用；⑨行手卫生时，因氯己定不能灭活新型冠状病毒[12]，注意避免使用含氯己定的洗手液。

4 结 论

由于临床标本接种后，培养基平板的原始区会有较多的原始标本的组织细胞存留，培养基在培养箱中培养时，培养箱的密闭空间内会聚集高浓度的气溶胶，检验人员在打开培养箱的瞬间接触到气溶胶，对人员的感染风险高，同时气溶胶可能飘散到实验室空气中，也会污染实验室环境。2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识中，明确提出细菌培养标本的接种须在生物安全柜中进行，培养基的细菌判读也应尽量在生物安全柜中进行。对此方法改进后，以培养罐(培养盒)为培养单位，所有培养罐(培养盒)的开盖操作均在生物安全柜中进行，不但实现了对培养基的所有操作环节均在生物安全柜中进行，而且避免了恒温培养箱中产生高浓度气溶胶风险，可谓一举两得，此过程最大限度避免了气溶胶传播的可能。

细菌培养的闭环操作、实验室感染性废弃物的彻底高压灭菌操作，实验室医疗垃圾分类处理的操作，各环节紧紧相扣，控制了实验室潜在病毒感染的风险，保障了实验室生物安全，实现了服务临床、服务患者的目的。培养箱和培养罐(培养盒)在细菌培养中，都是常规使用到的基础仪器，把这二者巧妙地组合使用，实现了最低风险转运培养基，最低风险读取培养基，将感染风险降到最低。口腔专科医院的标本量较综合医院少，可以实现全程细菌培养都在培养罐(培养盒)里面完成，减少了气溶胶对工作人员及实验仪器、实验环境的潜在污染。对于标本量较大的其他临床实验室，此方法也有一定的推广价值。可以仅仅将原始培养基在培养罐(培养盒)中完成，并在生物安全柜中闭环操作，在很大程度上能避免原始标本区气溶胶的污染风险，其生化鉴定和药物敏感性试验可以按常规处理。