乳酸菌粉培养基优化复配研究及应用

2020-06-03李鹏冲张立攀章建军赵梦瑶刘兵戈董建民

食品工业 2020年5期

李鹏冲，张立攀*，章建军，赵梦瑶，刘兵戈，董建民

河南省商业科学研究所有限责任公司（郑州 450002）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1]。乳酸菌是具有多重生理功能的微生物菌群，能够促进人体内乳酸酶的产生，使乳糖不耐症患者的发病率得到明显的降低[2]。乳酸菌发酵后产物赋予食品不同风味，另难以被人体消化吸收的大分子营养物质被分解，微量元素含量得到增加，提高了产品的营养价值和人体的吸收利用率[1]。乳酸菌能够调节肠道内的生物菌群，改善肠道功能且发酵后过氧化氢等抗性物质够抑制微生物的生长繁殖，可延缓产品腐败变质[3]。乳酸菌因对人们的身体健康有着不可忽视作用，使其受到社会各界广泛关注的目光，在食品行业中，中国的发酵乳制品占益生菌制品总量的1/2以上，并且每年的增长速度相当可观[4]。2015年果蔬发酵提出，便受关注，其主要是将多种乳酸菌种按照比例接到果蔬汁中。共同作用使果蔬汁发生复杂的生物学反应，饮料各项品质得到提高。目前，国内外已经研究出将有益微生物制成含有活菌菌体和代谢产物的益生菌制剂[5]。益生菌的应用更加趋向于多样化，必将成为未来发展的流行趋势。

传统的乳酸菌发酵剂制法不仅过程复杂繁琐，而且效果并不理想[6]。为此，企业迫切需要一种操作简单、含菌量高、直投式发酵剂。目前我国乳酸菌发酵剂操作系统不够完善，很多大中型企业生产所需要的发酵剂都通过国外获得。直投式乳酸菌粉具有活力高、适应能力强等优于传统发酵剂的特点，能够打破传统企业生产的局限，生产量得到大幅度提高[7]。因此研发一种适合我国企业生产的直投式发酵剂成为当前首要任务。

为了培育符合要求的乳酸菌粉，试验通过对培育乳酸菌的培养基中的营养素成分的比例进行调整以达到目的。目前很多知名专家都对乳酸菌发酵剂增菌培养基方面展开了研究，并且取得了相当不错的成绩。例如房兴利等[8]通过对MRS培养基、葡萄糖酵母培养基进行改良；刘宇峰等[9]用含有胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl、L-半胱氨酸的复合培养和天然脱脂乳培养基分别培养保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌得出脱脂乳优于复合培养基；姜晔[10]以胡萝卜汁作为生长促进剂。对于乳酸菌剂的保存，常压干燥法具有效果理想、成本较低的优势，很适合企业生产使用。研究的目标对乳酸菌粉载体和培养基的选择和优化，通过常压干燥的方法获得乳酸菌菌粉，为发酵果蔬提供科学依据。

1 试验材料与仪器

1.1 材料

菌种：植物乳酸菌、嗜酸乳酸菌为河南省商业科学研究所有限责任公司实验室保存菌种。

培养基：（1）种子液培养基为MRS肉汁种子培养基。载体培养基（简称DD培养基）山楂：山东沂蒙山楂优果。

1.2 主要试剂

MRS牛肉膏粉末为生化级试剂，葡萄糖均为分析纯试剂，β-环糊精、麦芽糊精、抗性糊精、大豆蛋白、菊粉均为食品级添加剂。

果胶酶（食品级，酶活力10 000 U/g）上海生物科技有限公司；无水乙醇（C2H6O）；硫酸（H2SO4优级纯）；氢氧化钠（40 g/L）等均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

JY2002电子天平，上海横平仪器表厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LH-250R生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；N2S可见分光光度测定仪，上海仪电分析仪器有限公司；离心机L550，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电磁炉JYC-21，九阳股份有限公司；生化培养箱LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 制备乳酸菌剂试验过程

将活化后的试管斜面保存菌种嗜酸乳酸菌和植物乳酸菌分别接种于含MRS液体培养基的三角瓶中，37℃培养24 h左右，然后接种于DD培养基中，混合均匀，置于37 ℃生化培养箱24 h培养。

2.2 单因素试验

2.2.1 碳源的添加量对菌株的影响

固定DD培养基中蛋白粉和水分的量，对葡萄糖进行调控。分别向DD培养基中添加2%，3%，4%，5%，6%和7%的葡萄糖。待所有成分都加完后混合搅拌均匀，置于生化培养箱中培养24 h。测其吸光度，确定最佳碳源量范围。

2.2.2 氮源的添加量对菌株的影响

固定DD培养基中葡萄糖和水的量，对蛋白粉进行调控。分别向载体中添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的蛋白粉，待所有成分都加完后混合搅拌均匀，放入生化培养箱中培养24 h。确定最佳氮源量范围。

2.2.3 水分的添加量对菌株的影响

固定DD培养基中葡萄糖和蛋白粉的量，对加水量进行调控。分别向载体中添加5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%的水量，待所有成分都加完后混合搅拌均匀，放入生化培养箱中培养24 h。确定最佳加水量范围。

2.3 正交试验优化培养基

根据单因素试验的结果，以乳酸菌的吸光度为考察指标，采用正交试验对葡萄糖（A）、蛋白粉（B）和水分添加量（C）3个因素进行考察，其中每个因素均有3个水平，见表1。

表1 DD培养基优化复配正交试验设计因素水平表

2.4 检测方法

接入菌种的载体培养基培养24 h，进行菌密度测定。菌量测定采用比浊法：1 g样品采用梯度稀释法稀释到100倍，从稀释100倍的样液中取一部分倒入比色皿中，以生理盐水作为参照，在600 nm波长处用可见分光光度仪对吸光度（A）进行测定。吸光度与菌落总数成正比。记录数据。

2.5 乳酸菌剂发酵山楂饮料的制备

2.5.1 工艺流程

山楂果挑拣→去核（称量）→清洗→加水煮制（100 ℃，10 min）→打浆→冷却→酶解（单宁酶、果胶酶）→灭酶→灭菌→发酵（乳酸菌剂）→成品

2.5.2 基础工艺条件

1) 参考张志军[11]的方法，用果胶酶对山楂汁进行处其工艺理略作调整：即酶解温度48 ℃，酶添加量为0.9%，酶解时间为4 h测相应指标。出汁率测定：参考任曼妮[12]的方法。含酸量测定：参考国标GB 5009.157—2016。还原糖测定：参考国标GB/T 15038—2006。

式中：W1为测得的单宁含量；C为由工作曲线查出的鞣酸质量浓度，μg/mL；m为称取的样品质量，g；V为样品溶液的体积，mL。

3) 参考李刚等[17]发酵山楂汁工艺略作修改：取酶处理并灭酶灭菌的山楂汁，接种量4%、发酵温度37℃、发酵时间18 h、混合糖添加质量分数为8%（蔗糖与葡萄糖质量比3∶2），进行培养发酵。

2.6 感官评价

对发酵山楂饮料的指标进行测定并进行感官评定。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌粉工艺优化分析

3.1.1 葡萄糖添加量对乳酸菌吸光度的影响

图1显示，随着葡萄糖的添加量的逐步增加，乳酸菌粉的吸光度呈上升趋势。当葡萄糖的添加量为6%时，菌粉的吸光度增长速度最快，当葡萄糖添加量继续上升时，菌粉的吸光度增长速度减缓，故试验中选择葡萄糖的添加量为6%左右。

图1 不同比例的葡萄糖添加量对乳酸菌吸光度的影响

3.1.2 蛋白粉添加量对乳酸菌吸光度的影响

图2显示，当蛋白粉的含量逐步增加时，菌粉的吸光度整体呈上升趋势。当葡萄糖的添加量为2.5%时，菌粉的吸光度增长速度最快，当蛋白粉添加量继续上升时，菌粉的吸光度增长速度减缓，故试验中选择蛋白粉的添加量为2.5%左右适宜。

(1)激光雷达技术的创新发展，主要指激光雷达系统中的硬件部分。创新和发展激光光源技术、发射和接收技术、信号采集和处理技术是提高大气环境监测精度的最直接方法。

3.1.3 加水量对乳酸菌吸光度的影响

图3显示了不同比例的水分含量对乳酸菌吸光度的影响结果。当水分含量逐步增加时，菌粉的吸光度在刚开始呈上升趋势，随着水分含量增加，乳酸菌吸光度反而下降。当葡萄糖的添加量为15.5%时，菌粉的吸光度增长速度最快，故试验中选择加水量为15.5%左右。

图2 添加不同比例的蛋白粉对乳酸菌吸光度的影响

图3 添加不同比例的水分对乳酸菌吸光度的影响

3.1.4 葡萄糖、蛋白粉及加水量对乳酸菌吸光度的影响

为了进一步了解葡萄糖、蛋白粉及加水量对乳酸菌吸光度的综合影响，试验对其进行了正交优化（表2），根据正交试验设计共得出9组试验结果（表3），其试验结果数据均为3次试验得到的平均值。结果见表3。

试验所制乳酸菌粉呈细小固体颗粒状，质感较为蓬松干燥，颜色呈米黄色，具有乳酸菌发酵气味。根据正交设计试验，由表2可得出，葡萄糖添加量（A）、蛋白粉添加量（B）和水分添加量（C）对菌粉中乳酸菌数量的影响顺序为：C＞A＞B。最佳组合为A3B1C3。在24 h培养前对乳酸菌粉进行检测，得出菌粉吸光度3次平均值为0.012，24 h培养后最佳菌粉组合吸光度3次平均值为0.049，增长量达到75%以上。即葡萄糖添加量为6%，蛋白粉添加量为2.5%，加水量为15.5%时，此时的菌粉中的乳酸菌含量最高，增长率高达408.3%，增菌效果显著。