宁夏某医院225例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变检测结果分析*

师志云，郭雅琪，江海峰，张玉英，赵 玥，赵倩颖，何学虎，梁小燕，董 洁，贾 伟△

1.宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏银川 750004；2.宁夏临床病原微生物重点实验室，宁夏银川 750004；3.宁夏医科大学总医院病理科，宁夏银川 750004

肺癌是全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，《2018年美国癌症统计》报告中指出2018年美国将出现173.5万例癌症新发病例和60.9万例癌症死亡病例，其中肺癌发病人数为12.1万例(14%)，死亡人数为11.2万例(13%)[1]。《A Cancer Journal for Clinicians》公布了2015年中国有429.2万新发肿瘤病例和281.4万肿瘤死亡病例[2]，肺癌是癌症死因之首。非小细胞肺癌(NSCLC)约占原发性肺癌的85%[3]，临床上大部分患者确诊时已为晚期[4]，失去了最佳手术治疗时机。

随着肿瘤分子生物学的发展，分子靶向治疗药物如小分子表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)的出现[5-6]，为NSCLC患者带来曙光。研究报道，EGFR基因突变是EGFR-TKI敏感的重要预测因子[7]。本试验采用的扩增阻滞突变系统(ARMS)法是目前检测 EGFR基因突变最为敏感的方法，对2014年1月至2017年12月在宁夏医科大学总医院就诊的225例NSCLC患者进行EGFR基因突变检测，并对其不同性别、年龄、民族、年份、季节、标本类型及病理类型进行比较分析，为判断疾病发展过程、预后及EGFR-TKI靶向治疗提供分子病理学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年1月至2017年12月在宁夏医科大学总医院住院的首次确诊或术后复发的晚期NSCLC患者225例为研究对象，其中男117例，女108例；年龄23～85岁，平均(58.9±11.0)岁；225例标本中组织石蜡切片201例，胸腔积液细胞蜡块24例；病理类型中腺癌204例，鳞癌12例，腺鳞癌6例，大细胞癌3例。纳入标准：(1)组织学或细胞学确诊为NSCLC；(2)在2014年1月1日至2017年12月31日首次确诊或术后复发的晚期NSCLC住院患者。排除标准：(1)没有病理确诊的NSCLC患者；(2)不符合纳入标准的其他情况的患者。

1.2试剂与仪器 FFPE DNA提取试剂盒(中国厦门艾德生物医药科技股份有限公司)、人类EGFR基因29种突变荧光PCR检测试剂盒(中国厦门艾德生物医药科技股份有限公司)；7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，DS-11微量核酸蛋白浓度测定仪(美国DeNovix公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 手术石蜡切片及细胞石蜡标本均经有经验的病理科医生进行质量评估，切取5～8张白片，装于EP管内，立即进行DNA提取。

1.3.2DNA提取 严格按照试剂说明书进行操作。

1.3.3DNA纯度及水平测定 A260/A280在1.8～2.0，DNA水平调整至2 ng/μL。

1.3.4ARMS-PCR检测 ARMS-PCR对EGFR基因编码区的4个外显子29种突变位点进行检测，所有试验均设阴、阳性对照。

1.3.5结果判读 严格按照试剂盒说明书提供的检验结果的解释进行判读。

1.4统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对所得数据进行统计学处理，计数资料以例数或百分率表示，组间比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1EGFR基因突变率及突变类型 225例患者中，EGFR基因共突变113例，总突变率为50.22%(113/225)。其中，最常见突变为19、21外显子，突变亚型最多的为19-del，共48例(21.33%)，其次为21-L858R，共40例(17.78%)。EGFR基因各种突变类型突变率相比，差异有统计学意义(χ2=148.209，P<0.05)，见表1。在113例突变中，共发现10例双位点突变，包括3例L858R和T790M双突变，2例G719X和S768I双突变，其余双突变(19-del和S768I，L858R和S768I，19-del和T790M，G719X和L861Q，G719X和T790M)各1例。

表1 EGFR基因突变率及突变类型

注：EGFR基因各种突变类型突变率相比，χ2=148.209，P<0.05。

2.2EGFR基因突变与临床特征的关系 225例患者中，男、女突变率分别为41.03%(48/117)和50.93%(55/108)，两者相比差异无统计学意义(P>0.05)；<60岁与≥60岁、汉族与回族突变率相比差异无统计学意义(P>0.05)；2014年(63.89%)至2017年(30.19%)EGFR基因突变率有明显下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。不同季节中，春季突变率最高(53.57%)，冬季突变率最低(34.55%)，四季突变率相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3EGFR基因突变与病理特征的关系 225例患者中，组织石蜡切片EGFR基因突变率46.27%(93/201)，胸腔积液细胞蜡块突变率41.67%(10/24)，两者相比差异无统计学意义(P>0.05)。病理类型中，腺癌标本占90.67%(204/225)，EGFR基因突变率最高，占49.02%(100/204)，各种病理类型突变率相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 EGFR基因突变与临床特征的关系

表3 EGFR基因突变与病理特征的关系

注：4种病理类型突变率相比，χ2=13.578，P<0.05。

3 讨 论

近年来，随着分子信号传导通路在NSCLC发生、发展机制中研究的深入，相应靶向药物的驱动基因包括EGFR基因、间变性大细胞淋巴瘤激酶(ALK) 融合基因、酪胺酸蛋白激酶(ROS1)基因重排逐渐成为热点，使NSCLC的治疗进入分子靶向治疗时代，且逐步实现个体化治疗。

EGFR是一种跨细胞膜糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因，其突变及过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关[8]。2017年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南[9]中建议对中晚期NSCLC患者进行EGFR基因常规检测，对于敏感突变患者推荐靶向药物作为一线治疗药物。目前EGFR-TKI已通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准的药物有一代吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等，二代阿法替尼(afatinib)和三代奥西替尼(osimertinib)等[10]。

既往研究表明，NSCLC患者的EGFR基因突变率在不同国家、地区存在一定差异，亚洲人种EGFR基因突变率(51.4%)高于北美或欧洲(10%左右)，且以女性、非吸烟、腺癌患者为主，达70%～80%[11-12]。本研究225例患者均采用ARMS-PCR进行EGFR基因突变检测，EGFR基因总突变率达50.22%(113/225)，其中包括男性患者发生突变48例，突变率41.03%(48/117)；女性患者发生突变55例，突变率50.93%(55/108)，二者差异无统计学意义(P>0.05)，考虑可能与样本量不大有关。<60岁突变率39.25%(42/107)与≥60岁突变率51.69%(61/118)相比，汉族突变率45.03%(86/191)与回族突变率50.00%(17/34)相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；春季(3-5月)突变率最高(53.57%)，冬季(12-2月)突变率最低(34.55%)，差异无统计学意义(P>0.05)；2014-2017年EGFR基因突变率有明显下降趋势，从63.89%下降到30.19%，差异有统计学意义(P<0.05)。

董强刚等[13]将176例NSCLC患者行EGFR基因检测，其中腺癌组患者中EGFR基因突变率为44.8%(30/67)，腺鳞癌组患者EGFR基因突变率为33.3%(10/30)，鳞癌组患者突变率为20.3%(13/64)，差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR基因突变在腺癌(或腺鳞癌)中突变率更高。本研究中，腺癌204例，突变100例，突变率49.02%；腺鳞癌6例，突变2例，突变率33.33%；鳞癌12例，突变1例，突变率8.33%，3种病理类型突变率差异有统计学意义(P<0.05)。本研究EGFR基因突变在腺癌的NSCLC中更为常见，腺癌、腺鳞癌EGFR突变率与国内其他报道相符[13-14]。

既往研究报道，EGFR基因不同突变位点的生物学功能各有不同，外显子18、19及21发生突变的NSCLC对EGFR-TKI具有良好疗效，外显子20中T790M突变是形成EGFR-TKI继发性耐药的重要机制之一[15]，且最常见突变为19号外显子的缺失突变19-del和21号外显子的L858R点突变[16]。WEI等[17]分析广西NSCLC患者EGFR基因突变率为35.7%(537/1 506)，且最常见的突变亚型为19-del(293/1 506，19.5%)和L858R(227/1 506，15.1%)，并分析这两个突变位点在性别、吸烟情况、病理类型方面差异无统计学意义(P>0.05)。在HSIEH等[18]的研究中，21号外显子突变所占比例更大(13/17，76.47%)。本研究中， 19-del缺失突变率为21.33%(48/225)，L858R点突变率为17.78%(40/225)，20外显子T790M耐药突变率为3.56%(8/225)，20外显子20-Ins插入突变(非敏感突变)突变率为1.33%(3/225)，同时发现10例EGFR基因双位点突变。EGFR基因总突变率与文献报道一致，只是突变类型比例稍有不同，考虑与样本量及人群选择有关。

因此，NSCLC患者中EGFR基因存在较高的突变率，其基因突变分型有助于筛选出适合EGFR-TKI肿瘤靶向治疗的人群，指导临床个体化用药及减轻患者的经济负担。