马流产沙门氏菌的分离鉴定及其微量凝集抗体检测方法的建立与应用

郭奎，王宁，王金慧，初晓雨，赵语婷，郭巍，刘荻萩，胡哲，王晓钧

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150069）

0 引言

【研究意义】建立一种敏感、特异、操作简便和高通量的微量凝集方法，实现对马流产沙门氏菌抗体进行快速检测，对马流产沙门氏菌引起的流产的流行病学调查具有重要意义。【前人研究进展】马流产沙门氏菌病，又称为马副伤寒，是由马流产沙门氏菌（Salmonella abortus equi）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium S. typhi）、都柏林沙门氏菌（S. dublin）等引起的以马属动物流产为特征的传染病[1-2]。其中马流产沙门氏菌是导致母马妊娠晚期流产主要病原菌[3]，且只对马属动物具有致病性，具有菌体抗原4、12，鞭毛第二相抗原H-enx。早在18世纪末19世纪初，欧美地区发生过大批马流产的现象，20世纪 70年代末，我国华北、西北、东北等养马地区也陆续暴发马流产沙门氏菌病，并造成了严重的经济损失，该病全年都可发生，主要发生于怀孕后期，大多数表现为散发，有时呈地方流行性。马流产沙门氏菌易感染初孕马，多数马在发生流产前，一般无明显临床症状，突发流产，绝大多数为死胎，有少数存活的胎儿，在出生几天后，也会发生死亡[4-5]。妊娠母马流产时, 病原菌随流产胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物排出体外, 病公马能随精液排菌[6]。感染马流产沙门氏菌的马常成为该菌的携带者，也通常被认为是非疫区最初传染源[7]。尽管该病在欧洲国家及美国等得到严格控制[8]，也有一些国家仍有零散发生，比如克罗地亚（欧洲）报道发生了 2起流产，流产率分别为 11%和 44%；非洲及亚洲国家，该病仍然尚未得到控制，该病在阿根廷和日本也有报道[7,10-11]；我国在20世纪80年代多次暴发该病[4-5,12-13]，但在之后的 30多年中，鲜有该病的报道，一直没有引起行业内的关注，国内外的相关研究并不多见，也不深入，是一种被忽视的传染病。直到 2014年我国内蒙古东部最先出现大批马流产，流产率高达66.7%，此后的几年里，我国多地持续流行该病，流产率为 30%—100%，其中大部分为草原上开放式散养的马群，该病的发生直接影响了我国马匹的存栏量、造成严重的经济损失。该病目前呈蔓延的趋势，对我国马业持续发展产生了潜在的威胁和巨大的影响，严重阻碍了我国马业的发展。细菌的病原学检测方法主要包括传统的细菌分离鉴定、革兰氏染色、生化特性分析、血清型的检测等，以及基因组PCR[14-18]鉴定、环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification LAMP）[19-20]等分子生物学手段。细菌的血清学方法主要有玻片凝集、试管凝集试验、微量凝集试验、ELISA等，其中微量试验的应用较为广泛。王晶钰等[21]建立了检测鸡大肠杆菌抗体的微量凝集试验，证实免疫后抗体效价与免疫保护效果呈正相关；徐为中等[22]建立了检测兔大肠杆菌的微量凝集方法，利用该方法监测免疫灭活疫苗后家兔大肠杆菌抗体水平。【本研究切入点】目前，还没有关于马流产沙门氏菌病原学系统的诊断方法，同时血清学的诊断方法也有限，主要依据传统的试管凝集试验进行诊断，然而该方法的凝集结果往往不易判读，使用试管操作难免耗时费力，不适合大样本的检测。急需建立一种有效的微量凝集方法，提高检测效率。【拟解决的关键问题】本研究采集疑似流产病例的流产马驹组织，进行了系统的病原学实验室诊断，对流产马驹的脏器进行常规的细菌分离和鉴定，并以其中一株分离株制备了凝集抗原，对比马流产沙门氏菌试管凝集血清学检测方法，旨在建立一种实现高通量新型微量凝集抗体检测方法，为临床马流产沙门氏菌病的诊断和疫苗抗体评估奠定基础。

1 材料与方法

试验于2018年3月至2019年9月在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，由马传染病与慢病毒病研究创新团队进行。

1.1 质粒和菌株及样品

PMD18T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自上海康为世纪有限公司；17份流产马驹组织（心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、脐带）采自内蒙古3个不同地区；120份马血清采自流产暴发地区，31份血清采取北京无流产疫情的地区。C77-1马流产沙门氏菌标准株购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂

沙门氏菌显色培养基购自上海欣中生物工程有限公司；沙门氏增菌液购自青岛高科园海博生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Gel Extraction Kit）、高纯度质粒小提试剂盒（Pureplasmid Mini Kit）等均购自康为世纪有限公司；细菌基因组 DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）购自TIANGEN；革兰氏染色液，沙门氏菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；马流产沙门氏菌鞭毛蛋白血清H：e,n,x（货号：53824）购自哈尔滨赛德洪泽科技发展有限公司；马流产沙门氏菌标准凝集抗原及阳性血清购自中国兽医药品监察所（效价为1∶6 400），马传染性贫血病毒（Equine infections anemin virus, EIAV）、马流感病毒（Equine innuenza virus, EIV,（H7N7、H3N8））、马疱疹病毒（Equine herpes virus, EHV, I型、II型、III型、IV型、VII型）、马动脉炎病毒（Equine arteritis virus, EAV）、马链球菌（Streptococcus equi,S.equi）、鼠伤寒沙门氏菌等阳性血清及马流产沙门氏菌阴性血清保存哈尔滨兽医研究所。

1.3 病原菌的初步分离及鉴定

用接种环沾取脏器浸出液，划线接种于沙门氏菌显色培养基上，37℃温箱培养18—24h，第二天观察菌落的颜色。在显色培养基上，革兰氏阳性菌被抑制，大肠埃希氏菌为蓝色。某些芽孢杆菌呈无色，沙门氏菌为淡紫色。挑取沙门氏菌选择培养基上可疑菌落，参照革兰氏染色说明书，进行革兰氏染色，并置于1 000倍光学显微观察下观察细菌的颜色、形态、大小。

1.4 分离菌16S rRNA鉴定及序列分析

挑取单菌落，接种于沙门氏菌选择培养基，37℃，180 r/min震荡培养12h，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取17株细菌DNA，并以此为模板，扩增16S rRNA基因。反应体系20 μL：2×Taq Master Mix，10 μL；P1/P2，1 μL； ddH2O，6 μL；模板，2 μL；反应条件为：预变性95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共35个循环；72℃终延伸7 min；待PCR反应结束后，取6 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析。获得预期大小目的条带后，将剩余PCR产物送去吉林库美生物公司进行测序。

1.5 沙门氏菌的生化鉴定及血清型鉴定

挑取16S rRNA鉴定为沙门氏菌的单菌落，参考生化鉴定试剂盒说明书进行生化鉴定，并在规定时间内判定结果。同时划线接种于 0.5%的低浓度琼脂的LB平板，37℃培养16h，参照沙门氏菌属血清型鉴定说明书，对菌株进行鉴定。

1.6 马流产沙门氏菌凝集抗原制备

选取E.S-1菌株，进行凝集抗原的制备。首先挑取单个菌落于5 mL沙门氏菌增菌液中，37℃，180 r/min培养16h，第二天以1∶100接种沙门氏菌增菌液，37℃，180 r/min培养8 h，参照平板计数法进行细菌计数。菌液按照 0.2%体积比例加入甲醛，在 28℃，130 r/min灭活，分别在灭活24、48 h后，进行灭活效果验证。完全灭活后，方可作为凝集抗原。

1.7 试管凝集试验

试管凝集试验按照NY_T570-2002行标进行，以分离株作为凝集抗原，根据购买的1∶6 400效价的标准阳性血清，确定凝集抗原工作浓度，并用于临床样品血清抗体的检测。

1.8 微量凝集试验最佳抗原浓度的确定

利用制备的凝集抗原，进行微量凝集试验反应条件的优化。对阳性血清，在96孔U型板上进行2倍比稀释，分别与作不同浓度稀释的抗原反应，并设生理盐水对照，利用封板膜封闭。室温放置，20 h后判定结果。选取微量凝集最佳的抗原浓度，从而确定最佳抗原浓度。判定条件：“＃”抗原抗体呈均匀分布，凝集成薄层，即 100%抗原被凝集 ；“+++”：凝集反应孔底能看到少许沉淀，即 75%抗原被凝集；“++ ”：凝集板底呈点状沉淀，但倾斜时，沉淀不流动，即50%抗原被凝集；“+” ：凝集板底有沉淀，但倾斜时，只有少许沉淀呈线状流动，即25%抗原被凝集；“-” ：凝集板底呈点状沉淀，但倾斜时，沉淀呈线状完全流下，即抗原未被或少部分血清被凝集。样品结果参考NY_T570-2002判定，阳性反应：1∶1 600 凝集强度达“++”或以上时，用“+”表示；可疑反应：1∶800 凝集强度达“++”或以上时，用“+”表示；阴性反应：1∶800 凝集强度只达“+”或以下时，用“-”表示。

1.9 敏感性试验

利用微量凝集优化的最佳抗原浓度（4亿/mL）、试管凝集凝集抗原浓度（2亿/mL）及马流产沙门氏菌参考凝集抗原[23]，对马流产沙门氏菌阳性血清（标定效价6400）进行检测，重复3次，每次3个重复。

1.10 特异性试验

利用微量凝集方法，对马流产沙门氏菌、马传染性贫血病病毒、马流感病毒（H7N7、H3N8）、马动脉炎病毒、马疱疹病毒（I型、II型、III型、IV型、VII型）、马腺疫链球菌、鼠伤寒沙门氏菌等标准阳性血清和阴性血清进行检测。

1.11 微量凝集对临床样本的检测

用微量凝集检测方法对临床151份马血清样品进行检测，并随机选取30份，做试管凝集试验，并对两种检测方法结果进行比较。

2 结果

2.1 沙门氏菌的分离及鉴定

沙门氏菌在沙门氏菌显色培养基上呈紫色，大肠杆菌呈蓝色，革兰氏阳性菌可抑制。从内蒙古地区（17/17）采集的各脏器划线结果可以观察到有大量紫色菌落（图 1），初步证明各脏器组织内含有沙门氏菌，分离菌分别命名为 E.S-1—17菌株。革兰氏染色镜检显示为革兰氏阴性短杆菌（图略）。

图1 沙门氏菌的分离与鉴定Fig. 1 Isolate and identification of Salmonella

2.2 16S rRNA克隆、鉴定及遗传分析

将获得17株分离株分别进行PCR扩增16S rRNA基因，扩增的产物经 1%琼脂糖凝胶电泳。电泳初步表明，获得了1条约1 500bp的特异性条带，与预期大小相一致（图 2）。将 E.S-1—17株的扩增产物进行测序，氨基酸同源性和核苷酸同源性分析结果表明，E.S-1—17的16S基因组与C77-1序列完全一致，同源性为100%，与同属沙门氏菌AL513382-Typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）、CP000026-Paratyphi A（甲型副伤寒沙门氏菌）、CP000857- Paratyphi C（丙型副伤寒沙门氏菌）、NZ_CM001062-Choleraesuis（猪霍乱沙门氏菌）、P125109-Enteritidis（肠炎沙门氏菌）同源性为 97.4%—99.7%，而与其他细菌同源性为38.4%—40.7%，选取E.S株的的序列进行进化树分析显示，沙门氏菌属与其他种属细菌的同源性低，具有独立的分支，属内细菌间同源性较高（图3）。

图2 16S 基因的PCR扩增Fig. 2 PCR amplification of 16S gene

图3 不同细菌16S rRNA 基因的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic trees of 16S rRNA gene of different bacteria

2.3 分离菌株血清型鉴定及生化鉴定

利用沙门氏菌属诊断血清及马流产沙门氏菌鞭毛蛋白血清H：e,n,x，对各菌株进行血清型鉴定（图4）：结果显示各菌株均与 O4-012混合血清（左图）及鞭毛第二相血清H-enx凝集（右图），获得的抗原式为O4,O12，H-e,n,x，经鉴定各分离菌株均为沙门氏菌B群的马流产沙门氏菌。将获得的17株马流产沙门氏菌和C77-1分别进行生化鉴定，结果如表1所示，标准株C77-1菌株与NY_T570-2002马流产沙门氏菌病诊断技术中所述一致；而E.S-1—17各株除不能发酵鼠李糖之外，其他生化鉴定结果均与C77-1结果一致。

2.4 试管凝集最佳抗原浓度的确定

根据试管凝集结果，确定了试管凝集最佳抗原浓度为 2亿/mL，该方法可以应用于临床样品血清抗体的检测。

表1 分离菌株的生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification of the E.S-1-17 strains

图4 马流产沙门氏菌的凝集结果Fig. 4 Result of agglutination for Salmonella abortus equi

2.5 微量凝集试验最佳抗原反应浓度的选择

由表2可以看出，当抗原（E.S-1）浓度为4亿/mL时，检测马流产沙门氏菌阳性血清的抗体凝集效价最高为1∶12 800，且结果最易判读。当抗原浓度2亿/mL以下时，则空白对照判读十分困难，因此选择4亿/mL为最佳抗原反应浓度。

表2 不同抗原浓度的微量凝集反应结果Table 2 Results of microagglutination with different antigen concentrations

2.6 敏感性试验

以E.S-1作为凝集抗原，分别利用试管凝集和微量凝集试验，检测马流产沙门氏菌阳性血清的效价，试管凝集效价阳性血清效价可以达到1∶6 400，微量凝集效价可以达到1∶12 800，利用参考凝集抗原，试管凝集效价结果表明阳性血清效价为1∶6 400。因此微量凝集敏感性高于试管凝集试验。

2.7 特异性试验

应用不同的马传染病阳性血清进行特异性试验，结果如表3所示，该微量凝集试验仅能检测出马流产沙门氏菌阳性血清（凝集效价为1∶12 800）为阳性，其他血清均为阴性（凝集效价均低于1∶1 600）。因此该方法对马流产沙门氏菌抗体检测具有良好的特异性。

2.8 微量凝集抗体检测方法的初步应用

应用微量对临床151份样品进行马流产沙门氏菌抗体的检测，以凝集价 1∶1 600为阳性判断标准，结果如表4所示，流产流行地区，马流产沙门氏菌抗体阳性率为27.3%—42.9%，非流产流行区，马流产沙门氏菌抗体阳性率0。为了比较两种方法的诊断敏感性，随机选取 30份临床样品，进一步进行了试管凝集抗体的检测，结果表明阳性率为10%（表5），低于微量凝集试验（33.3%），试管凝集阳性3份，微量凝集阳性10份，其中试管凝集阳性的3份，微量凝集结果均阳性，因此，以试管凝集为标准（表6），微量凝集诊断敏感性为100%（3/3），诊断特异性为74.1%（20/27）。

表3 微量凝集反应的特异性试验Table 3 Specific test results of microagglutination

表4 临床样本的检测Table 4 Test results of clinical samples

表5 两种检测方法的比较Table 5 Comparison of the two detection methods

表6 两种方法诊断敏感性的比较Table 6 Comparison of diagnostic sensitivity between the two methods

3 讨论

随着国家对赛马行业的开放及驴相关产业的快速发展，马驴的数量在不断上升。随之而来的传染病越来越多，病毒性疾病有马流感，马病毒性动脉炎、马鼻肺炎等，细菌性病有由马链球菌马亚种引起的腺疫、马流产沙门氏菌引起的流产等[24-25]。环境因素、饲养管理、细菌性因素，病毒性因素等均可引起马属动物的流产，其中细菌性流产占主要部分[26-27]。马流产沙门氏菌病自21世纪来在我国鲜有报道，近几年，马流产持续零散暴发，造成大量怀孕马流产，给我国马业造成巨大经济损失。但对发病原因一直没有深入研究，经过本试验对内蒙古流产马驹脏器进行系统的病原学检测，最终确认为马流产沙门氏菌感染。由此提示，该病已在我国内蒙古地区流行，需要及时采取针对性的预防和控制措施。NY_T570-2002马流产沙门氏菌病诊断技术明确指出，细菌学的检测结果是确诊马流产沙门氏菌病的依据。本研究通过沙门氏菌显色培养基筛选、革兰氏染色鉴定、16S基因组序列分析结果表明，从流产马驹分离到的17株均为沙门氏菌，利用沙门氏菌属血清型分析鉴定，E.S-1—17菌株，均具有菌体抗原O4，O12，鞭毛II相抗原H-enx，证明分离到的菌株为马流产沙门氏菌。利用各种型特异性鞭毛抗血清对细菌鞭毛蛋白抗原型的鉴定过程中，往往存在假阴性结果，主要是因为常规方法培养获得的菌体，鞭毛蛋白的表达不佳或者表达量很低，影响凝集结果的判定，可采取低浓度琼脂培养法，诱导鞭毛蛋白表达；此外也与H-enx血清质量有关。E.S-1—17菌株生化鉴定结果符合马流产沙门氏菌的生化特性，但与NY_T570-2002中马流产沙门氏菌菌株相比均不能发酵鼠李糖，这是新分离株在进化上形成的新的生化特性。

NY_T570-2002马流产沙门氏菌病诊断技术明确指出血清学检测结果是针对马流产沙门氏菌病的一种辅助手段，但血清学检查对马群的检疫是有意义的。由于该病很多年未发生，近几年该病突然暴发时，缺少可用商品化的凝集抗原，因此，为解决临床样本的检测，兽医生物技术国家重点实验室利用分离菌株，制备了凝集抗原，以马流产沙门氏菌标准阳性血清，优化了试管凝集抗原浓度（为 2亿/mL），但是试管凝集试验需要血清量大（送检的血清量有时满足不了要求），此外，试管凝集试验需要不断稀释，每次只能做一支试管，操作繁琐，不适合大量样本的检测，为克服试管凝集检测方法的弊端，本研究建立了一种微量凝集抗体检测方法，该方法与试管凝集相比，具有良好的操作性，可以多个样品同时进行稀释，而且可以同时判定多个样品凝集结果，在加样时间及判读结果时间上至少缩短20倍，提高了检测效率；血清用量减少50倍，凝集抗原量减少10倍，试管耗材等减少了使用，大大降低成本。本研究研制的微量凝集试验，特异性好，对其他马常见传染病阳性血清检测结果均阴性，敏感性比试管凝集高1个滴度，对于临床相同的30份样品，利用两种方法进行试验，微量凝集检测阳性率为 33.3%高于试管凝集（10%），以试管凝集结果为标准，微量凝集与试管凝集相比，诊断敏感性为100%，诊断特异性为74.1%。

利用建立的微量凝集检测方法，对151份马血清样品进行检测，流产暴发区马流产沙门氏菌抗体阳性率27.3 %—42.9%，略低于临床流产率（30 %—100%），可能有以下五个方面的原因：1.样品数量有限，不能代表整体的现状，此外临床流产时间不同，抗体有所差异。2.不同的病原也可以引起流产，如马 I型疱疹病毒、马VIII型疱疹病毒[28]、马动脉炎病毒，可能还有一些未知病原（本研究利用real-time PCR方法对马疱疹病毒、马动脉炎病毒核酸进行了排除）。3.非传染病因素如饲养管理、环境因素等。4.试验的判定标准可能偏高。笔者判定的标准是依据 NY_T570-2002国家行业标准进行的判定（反应20h，1∶1 600“++”及以上判定阳性，）。客观上，认为设定判定标准与疫病对人类的危害程度相关，对人类影响越大，判定阳性的稀释度越低。如牛羊布氏杆菌病 1∶50“++”以上时判定阳性[29]，5.不同病原抗体凝集试验的反应时间不同，理论上反应时间越长，对结果判定准确性越高，因此本研究反应时间为 20h。此外，本研究建立的微量凝集与杨康[30]建立的马流产沙门氏菌微量凝集方法不同，杨康建立的微量凝集反应时间为 2—3h，血清稀释度为1∶40，做4个重复，当出现“++”及以上时，即将样品判定阳性。判定标准过低，可能在一定程度上会造成假阳性，我们建立微量凝集，可以知道马流产沙门氏菌抗体的具体效价，是对研发新的疫苗效果评估的重要手段。

综上所述，本研究成功分离并鉴定出17株马流产沙门氏菌，并利用其中的一株E.S-1菌株作为凝集抗原，成功建立了检测马流产沙门氏菌抗体的微量凝集方法，该方法可以大批量操作，可以应用于临床各种马属动物的马流产沙门氏菌抗体及疫苗抗体效价检测，对于大规模疫病的监测和防控具有重要的意义。

4 结论

对流产马驹的脏器进行细菌分离，通过对分离菌进行沙门氏菌显色培养基、革兰氏染色、16S rRNA测定证实分离菌株为沙门氏菌；生化鉴定表明，分离菌株符合马流产沙门氏菌生化特性，但与C77-1相比，均不能发酵鼠李糖。通过利用低浓度琼脂诱导鞭毛蛋白表达，证实分离菌株血清型为马流产沙门氏菌，并将菌株命名为E.S-1—17，并以E.S-1菌株为凝集抗原，通过优化抗原浓度建立了微量凝集检测方法，该方法与试管凝集相比，具有较高的敏感性和批量操作性，更适合应用于马属动物的马流产沙门氏菌病的抗体检测以及疫苗免疫抗体消长规律的评价。