成蚊永久性玻片标本的制作

位广帅,刘彬彬,王红菊,王子鑫,张 浩,吕佳林,张 军,徐志喜,王国英

河南大学 基础医学院,河南 开封475004

蚊属于双翅目、蚊科,是重要的医学昆虫,对人类的直接危害是骚扰和吸血,间接危害是通过吸血传播病原体,其中的按蚊属、库蚊属、伊蚊属与疾病关系密切,是多种蚊媒传染病的重要传播媒介。蚊媒传染病是由病媒蚊子传播的自然疫源性疾病,主要包括伊蚊传播的登革热、基孔肯雅热、黄热病、寨卡病毒病和裂谷热等；按蚊传播的疟疾和淋巴丝虫病；库蚊传播的流行性乙型脑炎(乙脑)、西尼罗热和淋巴丝虫病等。蚊媒传染病在我国每年传染病总发病病例中约占5%～10%,但其病死数则占传染病总病死数30%～40%[1-2]。

控制蚊媒是控制蚊媒传染病的重要手段,对某些蚊媒疾病来说,甚至是唯一有效手段[3]。对捕获的蚊种进行鉴定是控制蚊媒的重要环节,对于防控蚊媒传染病意义重大。

成蚊形态是蚊种鉴定的主要依据,良好的成蚊永久性玻片标本,既是形态研究的需要,也是实验教学资源,并且可以长期保存。本实验对成蚊制片过程中使用和未使用体积分数为10%的氢氧化钾溶液的制片效果进行了比较,对体积分数为10%的氢氧化钾溶液消化成蚊的时间进行了量化及对比,以期得到更好的制片效果。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验使用的成蚊为淡色库蚊野外株。在河南省开封市金明区河南大学校区内的苗圃、车库、试验田、草地、绿化带等多个地点,通过捕蚊器采集。

1.2 采集工具

BGS-TRAP捕蚊器,由德国Biogent公司生产,南方医科大学公共卫生学院提供。捕蚊器是一个直径36 cm、高40 cm可折叠的蓝色织物容器,黑色网布覆盖在容器口上。容器中间有一个黑色的管道,可以将诱捕器附近的蚊子吸进诱捕器内[4]。

1.3 制片主要试剂与仪器

固定：体积分数为70%的乙醇；消化：体积分数为10%的氢氧化钾；脱水：体积分数为30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇；透明：无水乙醇与二甲苯(1∶1)混合液、纯二甲苯。

电子天平(型号：EL303；厂家：梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；电冰箱(型号：BCD-216TMZL；厂家：青岛海尔股份有限公司)；数码显微镜(型号：BA210；厂家：麦克奥迪实业集团有限公司)

1.4 制作方法

1.4.1 方法1

①冷冻：将收集的成蚊置于冰箱冷冻室10min后取出。②固定：成蚊置于体积分数为70%的乙醇固定液中12 h,取出后置于蒸馏水中浸泡30min。③脱水、透明与封片：依次放入体积分数为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脱水,各30 min；体积分数为100%的乙醇中脱水2次,每次30 min。无水乙醇与二甲苯(比例1∶1)混合液中透明30 min；纯二甲苯中透明60 s。将成蚊置于载玻片上,滴两滴中性树胶,加盖玻片,平置标本盒内,室温阴干。

1.4.2 方法2

①冷冻：将收集的成蚊置于冰箱冷冻室10 min后取出。②固定、消化：成蚊置于体积分数为70%的乙醇固定液中12 h,取出后置于蒸馏水中浸泡30 min；取出后置于体积分数为10%的氢氧化钾溶液中消化2 h,然后,蒸馏水浸泡2次,每次30 min。③脱水、透明与封片：依次放入体积分数为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中脱水,各30 min；体积分数为100%的乙醇中脱水2次,每次30 min。无水乙醇与二甲苯(比例1∶1)混合液中透明30 min；纯二甲苯中透明60 s。将成蚊置于载玻片上,滴两滴中性树胶,加盖玻片,平置标本盒内,室温阴干。

1.4.3 方法3

成蚊置于体积分数为10%的氢氧化钾溶液中消化4 h。其他操作步骤同方法2。

1.4.4 方法4

成蚊置于体积分数为10%的氢氧化钾溶液中消化6 h。其他操作步骤同方法2。

1.4.5 方法5

成蚊置于体积分数为10%的氢氧化钾溶液中消化8 h。其他操作步骤同方法2。

2 结果

2.1 方法1制作的标本

光镜下(40×)观察雌蚊：头部黑色,复眼结构不能辨认；触角分节、暗黄褐色,各鞭节轮毛短而稀；触须短棒状、分节、暗黄褐色,短于喙之半；喙长针状、暗黄褐色,末端唇瓣可见；胸部暗黄褐色；腹部分节,腹末尾须可见,部分腹节内有黑褐色条状物；蚊翅狭长、浅黄褐色；蚊足细长、黄褐色,分节明显(图1A)。光镜下(40×)观察雄蚊：头部黑色,复眼结构不能辨认；触角分节、暗黄褐色,各鞭节轮毛长而密；触须细长、分节、黄褐色,比喙长；喙长针状、黄褐色,末端唇瓣可见；胸部黄褐色；腹部分节,靠近胸部的腹节呈黄褐色,靠近尾部的腹节呈暗黄褐色,尾部的钳状抱握器可见；蚊翅狭长、浅黄褐色；蚊足细长、黄褐色,分节明显(图1B)。

2.2 方法2制作的标本

光镜下(40×)观察雌蚊：头部暗黄褐色,复眼部位呈较暗的浅紫色,小眼较模糊,不够清晰；触角分节、暗黄褐色,各鞭节轮毛短而稀；触须短棒状、分节、暗黄褐色,短于喙之半；喙长针状、暗黄褐色,末端唇瓣可见；胸部呈黄褐色；腹部分节呈较亮的黄褐色,腹末尾须可见,结构清晰；蚊翅狭长、浅黄褐色；蚊足细长、黄褐色,分节明显(图1C)。光镜下(40×)观察雄蚊：头部暗黄褐色,复眼部位呈较暗的浅紫色,结构模糊；触角分节、黄褐色,各鞭节轮毛长而密；触须细长、分节、黄褐色,比喙长；喙长针状、黄褐色,末端唇瓣可见；胸部黄褐色；腹部分节,呈黄褐色,尾部的钳状抱握器清晰可见；蚊翅狭长、浅黄褐色；蚊足细长、黄褐色,分节明显(图1D)。

图1 方法1～5制作的成蚊标本(40×)

2.3 方法3制作的标本

光镜下(40×)观察雌蚊：头部暗黄褐色,复眼呈较暗的浅紫色,小眼能模糊辨认；其他观察结果同方法2制作的雌蚊(图1 E)。光镜下(40×)观察雄蚊：头部暗黄褐色,复眼部位呈较暗的浅紫色,小眼结构能辨认；其他观察结果同方法2制作的雄蚊(图1F)。

2.4 方法4制作的标本

光镜下(40×)观察雌蚊：头部黄褐色,复眼浅紫色,小眼能辨认；其他观察结果同方法2制作的雌蚊(图1G)。光镜下(40×)观察雄蚊：头部黄褐色,复眼浅紫色,小眼结构能辨认；其他观察结果同方法2制作的雄蚊(图1 H)。

2.5 方法5制作的标本

光镜下(40×)观察雌蚊：头部黄褐色,复眼浅紫色,小眼能辨认；其他观察结果同方法2制作的雌蚊(图1I)。光镜下(40×)观察雄蚊：头部黄褐色,复眼浅紫色,小眼能辨认；其他观察结果同方法2制作的雄蚊(图1J)。

2.6 不同光镜下观察结果比较

光镜下(100×)观察雌、雄蚊头部,复眼浅紫色、由许多小眼构成；小眼能清晰辨认。正面观：每一个小眼均与周围的六个小眼相邻,由于之间排列紧密、无缝隙,所以每个小眼呈现近似正六边形形状；复眼正面观,结构与蜂巢相似。侧面观：小眼排列近似鱼鳞状(图2K：方法5制作的雌蚊头部；图2M：方法4制作的雄蚊头部)。

图2 方法4～5制作的成蚊头部标本(100×、400×)

光镜下(400×)观察雌、雄蚊头部,复眼浅紫色、由许多小眼构成；小眼能清晰辨认。正面观：每个小眼的形状为近似小米粒的泡状结构,相邻小眼排列紧密、无缝隙,形成复眼的表面。小眼的一部分在表面之上,形成规则的泡状凸起,小眼的一部分在表面之下。侧面观：凸起的泡状结构更明显(图2L：方法5制作的雌蚊头部；图2N：方法4制作的雄蚊头部)。

3 讨论

成蚊鉴定主要依赖形态学手段,蚊虫的生物学和形态分类学等研究是有效控制它们的前提,完好的标本是开展蚊虫形态分类等研究的基础[5-6]。成蚊标本常用的制作方法有两种,一种是针插法,一种是永久性玻片标本制作。用针插法制成的标本,不损坏虫体上的鳞片或刚毛,并保持标本原有的色泽,

且便于用解剖镜或放大镜进行观察,但易受到虫蛀或霉变的影响,导致损坏而不易长期保存。永久性玻片标本,能够长期保存,而且在显微镜下可以观察虫体的细微结构,非常适合科研和教学使用。

本实验采用5种方法制作成蚊永久性玻片标本。方法2、3、4、5均使用了体积分数为10%的氢氧化钾溶液对成蚊进行消化,消化时间分别为：2、4、6、8 h。消化时间较短时,如消化2h时和4h制作的标本,镜下(40×)观察复眼结构不清晰。消化时间6 h或8 h时,制作的标本镜下(40×)观察复眼结构清晰。消化时间6 h或8 h时,镜下(400×或100×)观察,显示复眼由许多小眼构成,数量不定；正面观每个小眼呈现近似正六边形形状,与周围的六个小眼相邻,排列紧密、无缝隙,结构与蜂巢相似；侧面观小眼呈规则的泡状凸起,排列近似鱼鳞状。

体积分数为10%的氢氧化钾对蚊体的处理,能够使蚊体内部软组织溶解并使几丁质色素减退[7]。消化时间不同,制作标本的观察效果有较大差异,主要在蚊头部结构的清晰度及复眼结构能否辨认、结构是否清晰,而对其他结构的观察,影响较小。

方法1没有使用体积分数为10%的氢氧化钾溶液对成蚊进行消化,制作的标本镜下(40×)观察,蚊头部呈黑色,复眼结构不能辨认,腹节内的内容物也存在,说明在制作过程中若不对成蚊进行消化处理,直接影响玻片标本的观察,特别是蚊头部复眼,完全不能观察；其他结构镜下可以观察,但效果不佳。

关于成蚊永久性玻片标本的制作,文献报道[7]需用体积分数为10%的氢氧化钾溶液浸泡,浸泡时间需要视标本的情况而定。消化时间不固定,不同的制作者认定的消化效果没有统一标准,根据个人的经验和观察而定,制作的标本观察效果可能有较大差别。

在成蚊标本制作过程中,每一步骤都关系标本的观察效果,消化步骤尤其重要。本实验量化了体积分数为10%的氢氧化钾溶液对成蚊的消化时间,使制作过程更易操作。实验结果显示,使用体积分数为10%的氢氧化钾溶液对成蚊消化6 h或8h,制作的标本镜下观察结构清晰,适用于科研、教学。