改进TRIzol法提取不同发育时期海葵的总RNA

袁 琳， 代亚坤， 高炳淼

(海南医学院 药学院/热带转化医学教育部重点实验室/海南省热带药用植物研究开发重点实验室， 海南 海口 571199)

海葵(Sea anemone)又名海菊花，属腔肠动物门珊瑚虫纲六放珊瑚亚纲海葵目[1]，是原始海洋生物。现代药理研究表明，海葵毒素具有免疫调节、抗菌、降血压[2]、强心[3]、抗寄生虫[4]和抗肿瘤[5]等药理活性。海葵资源的研究前景广阔，不仅可食用、药用，还可向化工、饲料、农药、化妆品等方向转化和应用[6]。获得纯度高、完整性好的高质量RNA是南海海葵进行分子生物学研究的重要前提[7]，对c DNA文库构建和转录组测序等的深入研究具有重要意义，提高RNA纯度及经济快捷获得足量的RNA是当前受到关注的问题。

目前，传统提取RNA的方法有热酚法[8]、Trizol法[9]、异硫氰酸胍法[10]、氯化胍法[11]、CTAB法、SDS法等，但没有一种RNA提取方法适用于所有的生物。对海葵的研究主要集中在海葵毒素的提取分离、化学合成、药理活性等方面，国内少见关于海葵RNA提取分离方面的报道。因此，以南海海葵为研究对象，采用改进TRIzol法[12]提取海葵不同发育时期的总RNA，经琼脂糖电泳和Agilent 2100生物分析仪检测 RNA的完整性和纯度，获得海葵纯度高、完整性好的高质量RNA,以期为海葵高通量转录组测序等分子生物学的深入研究提供基础，也为其他海洋生物RNA的提取提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品材料不同发育期的海葵，采自南海海域，经鉴定为套膜海葵(Aiptasiapallida)，选择早中晚3个发育时期的海葵各1只，样品名称分别为海葵-小、海葵-中和海葵-大。海葵样品经去离子水冲洗干净，于-80℃冰箱冷冻储存备用。

1.1.2试剂DEPC和TRIzol试剂盒(赛百盛公司)，RNA locker和RNA down(天泽基因工程有限公司)，RNase Inhibitor(TaKaRa公司)，其他试剂均为分析纯。

1.1.3仪器Agilent 2100生物分析仪(美国安捷伦公司)，Nano Drop TM 2000分光光度计(Thermo Fisher，USA)，电泳仪(凝胶成像仪为美国伯乐公司)。

1.2方法

1.2.1海葵总RNA的提取采用改进TRIzol一步法提取不同发育期海葵的总RNA[12]。具体步骤：将海葵放入冷的600 μL RNA locker中，静置1 min后匀浆；将匀浆液充分震荡，室温静置10 min；加入300 μL氯仿，充分震荡，室温静置后离心；异丙醇沉淀 RNA时，加入5 μL的RNA down，再加入500 μL的异丙醇，振荡后于20℃静置 30～60 min后离心；75%乙醇洗涤，室温干燥RNA沉淀；加入适量DEPC处理水(含RNase Inhibitor，终浓度为0.2 U/μL)，4℃下溶解2～6 h后于-70℃保存。

1.2.2总RNA的初步检测分别取海葵-小、海葵-中、海葵-大RNA样品与溴酚蓝上样缓冲液混合，加入含Goldview的1.0%琼脂糖凝胶，180V电泳16 min，然后用凝胶成像仪拍照保存。

1.2.3总 RNA的质量检测将RNA样品在冰上融化，混匀后4℃离心。分别取RNA提取液各1 μL，稀释100倍后，Nano Drop TM 2000分光光度计检测总RNA的纯度(OD260/280)和浓度[13]。Agilent 2100生物分析仪对RNA完整性的质量评估参数，能准确而直观地评估RNA样品的质量[13]，并筛选出高质量样本，因此，采用Agilent 2100生物分析仪自动检测不同发育时期海葵的总RNA的完整性(RIN值)。质检等级分为A、B、C 3个等级， A级指质量满足建库测序要求，且总量可满足2次或2次以上建库需要的样品；B级指质量满足建库测序要求，且总量满足1次但不足2次建库需要的样品；C级指质量/总量不完全满足建库测序要求，可以风险建库，但不保证测序样品的质量。28S/18S为衡量提取的RNA降解情况及完整性的指标，28S/18S在1.8～2.0则表明所提取RNA基本无降解发生，且完整性较好。

2结果与分析

2.1改进TRIzol法提取海葵总RNA的效果

由图 1可知，3个发育时期的海葵总RNA的28S和18S条带清晰，5S条带模糊。28S条带较18S条带更明亮。28S条带与点样孔间无明显亮带，说明无DNA污染条带[14]。初步检测说明，采用改进TRIzol法提取海葵总RNA的琼脂糖电泳结果较好，改进TRIzol法能有效提取海葵不同发育时期的总RNA。

注：M为低分子量蛋白Marker；1、2和3分别表示海葵-大、海葵-中和海葵-小的总RNA条带。

Note: M, Marker; 1, 2 and 3 indicate total RNA bands in large, medium and small sea anemones respectively.

图1 改进TRIzol法提取海葵总RNA的效果

Fig.1 Total RNA extraction from sea anemone by improved TRIzol method

2.2海葵总RNA的质量

从表1可看出改进TRIzol法提取不同发育时期海葵总RNA的质量。

2.2.1浓度改进TRIzol法提取不同发育时期海葵总RNA的浓度以海葵-中最大，为357 ng/μL；海葵-大其次，为335 ng/μL；海葵-小最低，为232 ng/μL。

2.2.2 纯度海葵-小、海葵-中和海葵-大总RNA的OD260/280值分别为2.071、1.983和1.981，依据纯RNA的标准(1.9

2.2.3完整性海葵-小的RIN值较小，为6.4；28S/18S为1，与1.8～2.0相差较大；质检等级为C。说明海葵-小的完整性不合格，纯度较低，有轻微杂质污染，其质量或总量不完全满足建库测序要求，可以风险建库，但不能保证测序样品的质量。海葵-中与海葵-大的RIN值分别为7.3和8.8，均大于7；28S/18S分别为2.4和1.9，均大于1.8；质检等级均为A。说明，海葵-中和海葵-大的总RNA完整性较高，总RNA的质量满足建库测序要求，且总量可满足2次或2次以上建库需要的样品，可用于进行后续试验。

表1 改进TRIzol法提取不同发育时期海葵总RNA的质量

3结论与讨论

随着分子生物技术在生物学、医学等方面的广泛应用，RNA提取已成为研究基因表达、克隆目的基因等的一项基本试验技术。高质量RNA的提取，是后续RT-PCR、Northern blot、c DNA文库构建等正常进行的必要前提[15]。动物组织RNA的提取技术已非常成熟，已有大量研究者利用各种方法和商业化试剂成功提取高质量的RNA[16-17]。由于RNA非常不稳定，易降解，且RNA酶的存在使得提取完整性好、质量高的RNA变得尤其重要[18]。因此，有效抑制RNA酶活性及去除蛋白质和DNA的污染是获得高质量RNA的关键[19]。热酚、TRIzol等传统提取RNA的方法可很好地提取微生物和动物组织的RNA[20]，其中，TRIzol法是用于提取少量组织总RNA的经典方法，但传统TRIzol法提取总RNA效果较差，RNA易降解，改进TRIzol法能有效提高RNA产率，减少RNA降解，延长RNA储存时间[12]。

采用改进TRIzol法提取不同发育时期海葵的总RNA，并对其质量进行检测。结果表明，中晚期海葵总RNA的OD260/280值约为2.0，纯度较高，是高质量RNA的标志[17]。采用改进TRIzol法所提取的海葵RNA条带整齐、清晰，海葵-大与海葵-中的总RNA完整性较好，RIN值分别为8.8和7.3，海葵-大与海葵-中的带型呈现28S∶18S约为2∶1，说明RNA基本无降解，且完整性好[21]。采用Nano Drop TM 2000分光光度计对总RNA纯度(OD260/280)的检测、Agilent 2100生物分析仪质量检测与电泳检测均强有力地支持以上结果。

综上，采用改进TRIzol法提取不同发育期海葵总RNA的浓度高、纯度和完整性较好，改进TRIzol法能有效提取海葵不同发育时期的总RNA，满足转录组测序等分子生物学试验要求，可为海葵进行高通量转录组测序等分子生物学试验提供基础，同时也可为海洋动物RNA的提取提供参考。