不同作物间作对烤烟根际土壤细菌群落组成及功能的影响

张开虹， 桑维钧， 何世芳， 袁清婷， 徐敏菊

(贵州大学 烟草学院， 贵州 贵阳 550025)

植物根系与土壤发生相互作用紧密的微域环境，称之为根际环境(Rhizosphere)，包括碳水化合物、氨基酸以及生长物质等诸多成分，是植物在生长、吸收及分泌过程中形成的物理、化学、生物学性质不同于土体的复杂动态微型生态系统。土壤微生物作为土壤环境的重要组成部分，会形成各种有机酸、激素、抗生素、醇和维生素等多种产物，从而影响土壤养分的供应状况，改变植物根际土壤营养和氧化还原条件等，在土壤养分和有机质的转化与增加过程中发挥着重要作用，进而对植物的生长发育及产质量产生影响[1]。土壤微生物的种类、数目及活性可宏观且真实地反映土壤的营养状况[2]。土壤微生物区系失衡和多样性是土壤传播植物病害的潜在原因[3]。优良健康的根际环境是农作物生长的重要基础，了解根际土壤微生物群落结构组成的多样性及其影响因素对农作物生长及污染土地修复等都具有重要意义。

利用植物与微生物互作提高资源利用，减少农药和化肥的投入是农业绿色发展的重要内容之一。大量研究表明，间套作和轮作模式中作物通过直接或间接作用改变土壤环境，能够使植物充分利用水分和养分、抑制杂草滋生和控制病虫害等[4-8]。但目前有关烤烟种植土壤微的生物区系，尤其是间套作条件下的烤烟根际土壤微生物环境的研究较少。一直以来，在实际生产上烤烟套作甘薯的种植方法已很普遍[9]。有研究表明，烤烟套作甘薯不仅可一定程度上改善烟叶的内在品质，显著提高烤烟烟叶总糖含量、还原糖含量和糖碱比，降低氯含量[10]，还能在病虫害防治方面减轻烤烟病毒病、角斑病和野火病的危害[11-12]。而间作甘薯是否也能够具有相似效果还缺乏研究。丹参是一种唇形科药用植物，在全国大部分地区都有分布，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物之一[13]，与大多数作物一样在栽培过程中存在连作障碍，但其与烤烟间作效果如何未见研究报道。利用豆科作物与根瘤菌共生产生的固氮作用，豆科与非豆科作物间套作也是传统间套作的重要种植模式之一。蚕豆与玉米间作能够提高玉米对养分的吸收量及其产量[14-16]，鲜见该模式在烤烟上的研究报道。为此，以单作烤烟为对照，选择甘薯〔Ipomoeabatatas(L.) Lam.〕、丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)和大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕3种不同类型作物，研究3种不同作物与烤烟间作对根际土壤细菌群落组成及功能的影响，以期为连作障碍的生态调控提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验于2018年4-8月在贵州省遵义市绥阳县蒲场烟草科技示范园(107°08′E,27°89′N)进行，该地属亚热带湿润季风气候，年平均降雨量在900～1 250 mm，无霜期280 d左右。

1.2材料

1.2.1烤烟品种云烟87，当地生产上的主栽品种。

1.2.2土壤样品共计48份，采自烤烟-甘薯、烤烟-丹参(B)、烤烟-大豆和单作烤烟(CK)4个处理的烤烟根际的土壤，每个处理12份。

1.3方法

1.3.1试验设计间作共设4个处理：单作烤烟为对照(CK)；A，烤烟-甘薯；B，烤烟-丹参；C，烤烟-大豆。3次重复，共12个小区，均匀轮替分布。烤烟间距50 cm，烤烟移栽后10 d间作甘薯、丹参和大豆。甘薯与丹参采用移栽种植，大豆在3 cm土层穴播，每穴播种3～4粒，间作作物与烟株均间隔15 cm左右(图1)。试验期间除草灌溉、病虫害防治等管理措施按常规方法进行。

Fig.1 Schematic layout of tobacco intercropped withI.batatas,S.miltiorrhizaandG.max

1.3.2样品采集烤烟于移栽后的第10天与甘薯、丹参和大豆间作，分别于还苗期(T1)、伸根期(T2)、旺长期(T3)和成熟期(T4)采集4个间作处理的烤烟根际土壤。T1为间作当天第1次采集土样的时期(还苗期),以后每隔25 d采样1次，即T2、T3和T4对应烤烟的生育期分别为伸根期、旺长期和成熟期。

每个小区随机选取4株烤烟连根拔起，抖掉周围土壤，将每个重复的根际土壤用毛刷分别刷入灭菌袋内，将相同小区土样混合。将采得土样放置干冰盒中，带回实验室于-80℃保存，用于后续DNA提取。

1.3.3土壤DNA提取与测序采用CTAB法提取样本的基因组DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模版，采用16S rRNA基因中的V3～V4区引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)进行扩增。PCR扩增条件：98℃预变性1 min，98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环，然后再在72℃延伸5 min。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后再次进行琼脂糖凝胶电泳确认，再用GeneJET胶回收试剂盒(Thermo Scientific)剪切回收目标条带。高通量测序基于半导体芯片技术的IonS5TMXL测序平台，测序深度为每个文库原始读数(reads)不少于4万条，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4数据处理与分析

1) 样品有效序列的获取。初始数据按照Barcode序列和PCR扩增引物序列拆分出各样品数据，将Barcode序列和引物序列截去后，经FLASH对每个样品的读数进行拼接，获得原始数据(Raw Data)，然后参照QIIME对原始数据进行拼接过滤后得到有效数据(Clean Data)。

2) 样品有效序列的可分类单元(OTUs)聚类。使用UPARSE将有效数据以97%相似性(Identity)为依据进行可分类单元(OTUs)聚类，每个OUT代表1个物种。

3) 细菌的群落多样性。采用R软件绘制稀释曲线反映土壤样品中的细菌信息，依据聚类结果再用QIIME进行Alpha多样性计算分析和对每个OTU的代表序列进行物种注释，得到相应的物种信息和相对丰度分布情况。采用群落丰富度Ace指数和Chao1指数以及群落多样性香农指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)进行评估，以平均覆盖度(Goods coverage)反映测序深度。

4) 细菌代谢功能的预测。Tax4Fun是基于16S Silva数据库的用于肠道、土壤等环节样品功能预测的R程序包，利用其对基于细菌群落16S rRNA的代谢功能进行预测。

2结果与分析

2.1样品有效数据信息的可分类单元(OTUs)聚类

不同作物间作烤烟根际土壤48份样品16s RNA的V3～V4区测序结果显示，共获得3 667 900条有效序列，平均每个样品得到76 415条有效序列，质控有效率达93.77%。有效序列以97%的一致性将可分类单元(OTUs)聚类共得到6584个OTUs。测序深度可全面覆盖土壤样品中绝大多数的细菌信息，能够较好地反映烤烟根际土壤样品中细菌的群落多样性。

2.2细菌的Alpha多样性

从表1可知，随着烤烟生长发育进程的延长，不同作物间作烤烟根际土壤细菌群落的丰富度、多样性和平均覆盖度的变化。丰富度：A、B、C、CK的Ace指数分别为T2>T4>T3>T1、T3>T2>T4>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T2>T1，Chao1指数分别为T2>T4>T3>T1、T3>T4>T2>T1、T2>T3>T4>T1和T3>T4>T1>T2。多样性：A、B、C、CK的香农指数分别为T4>T2>T3>T1、T4>T3>T2>T1、T4>T2>T3>T1和T2>T4>T3>T1，辛普森指数分别为T2=T3>T1=T4、T2=T3=T4>T1、T2=T4>T3>T1和T2=T3=T4>T1。平均覆盖度：A、B、C、CK分别为T1>T3>T4>T2、T1>T4>T2>T3、T1>T4>T3>T2和T2>T1>T4>T3。其中，细菌的丰富度Chao1指数，T2与T1比，CK下降3.74%，A、B和C分别上升20.22%、6.65%和23.79%；T3与T2比，B和CK分别上升4.49%和8.53%，A和C分别下降11.96%和2.91%；T4与T3比，A上升9.55%，B、C和CK分别下降4.16%、0.91%和2.55%。细菌的群落多样性，T2与T1比，各处理土样细菌的群落多样性均呈上升趋势，C上升幅度最大，为5.32%；T3与T2比，A、C和CK的细菌群落多样性均呈小幅下降趋势，B上升0.30%；T4与T3比，细菌群落多样性均呈上升趋势。

表1 不同作物间作烤烟根际土壤细菌的Alpha多样性

2.3细菌的群落结构

从不同作物间作烤烟根际土壤得到的6 584个OTUs序列进行物种注释，共有2 480(37.67%)个OTU注释到属水平。根据注释结果统计分析，48个土壤样品共检测到50个门、58个纲、130个目、237个科和574个属。

从图2看出，在门水平上相对丰度列前10位的物种包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，为烤烟根际土壤的主要细菌类群(平均丰度>5%)，高于其他优势菌群，约占总菌群的83.90%，并在烤烟各个生长时期平均丰度均较高。其中，变形菌门的相对丰度在各处理中都随烤烟生长发育时期而降低，至T3降至最低，T4上升，各处理无明显差异；放线菌门的相对丰度 A、B和C都呈波动式变化，T2降至最低、T3升至最高、T4又下降；CK则为T2和T3上升，T4下降，且T3的放线菌门的相对丰度最高；酸杆菌门的相对丰度虽然CK、A和C均为T2升至最高后下降，B至T3升至最高后下降，但各时期酸杆菌门的相对丰度在各处理中的差异不大；拟杆菌门的相对丰度CK随烤烟生长发育呈逐渐降低趋势，A、B和C都在T2达最高，T3呈降低趋势，T3的降低更明显，T4的A和C持续降低，但B呈上升趋势。

从图3看出，不同作物间作烤烟根际土壤样本在属水平上丰度列前15位的物种中，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、鞘脂菌属(Sphingobium)、未分类的甲烷球菌类(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium、Devosia、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、马赛菌属(Massilia)，未分类的酸杆菌类(unidentifiedAcidobacteria)为优势菌属(相对丰度>1%)。

2.4细菌功能的预测

经Tax4Fun对不同作物间作烤烟根际土壤细菌群落16S rRNA的代谢功能预测结果表明，在一级功能层共获得代谢(Metabolism)、遗传信息处理(Genetic information processing)、环境信息处理(Environmental information processing)、细胞过程(Cellular processes)、人类疾病(Human diseases)和有机系统(Organismal systems)六类生物代谢通路功能。其中，属水平上位列前15细菌的代谢、遗传信息处理和环境信息处理为其功能预测主要组成，分别占47.22%～48.14%、19.82%～20.78%和13.40%～14.48%。随烤烟生长发育，代谢、遗传信息处理和有机系统占比逐渐上升，T3升至最高，T4下降，环境信息处理和人类疾病与此相反，随烤烟生育时期占比逐渐降低，T3降至最低，T4上升，细胞过程占比呈波动式变化，T2和T4呈上升趋势，T3呈下降趋势。从图4看出，二级功能层由44个子功能组成，其中包括碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(Amino acid metabolism)、膜运输(Membrane transport)、翻译(Translation)、复制和修复(Replication and repair)、能量代谢(Energy metabolism)、信号转导(Signal transduction)、脂质代谢(Lipid metabolism)、辅助因子与维生素的代谢(Metabolism of cofactors and vitamins)和核苷酸代谢(Nucleotide metabolism)等。

3结论与讨论

土壤微生物作为农业生态系统中重要的组成部分，对维持生态系统平衡起着重要作用。早期对土壤微生物的研究受技术限制，依赖于人工分离培养技术，然而土壤中绝大多数微生物无法在实验室条件下分离存活。高通测序技术的发展，可同时对多种微生物基因组进行测序，相较于传统的分离培养方法有助于更好地深入研究微生物与作物生长发育之间的关系，为克服连作障碍提供数据支撑[17]。随着下一代测序技术的迅速发展与普及，16S rDNA扩增子测序技术被认为是土壤微生物多样性研究较好的方法之一。基于半导体芯片技术的IonS5TMXL高通量测序已成为研究环境样品中微生物群落组成结构及多样性的重要手段。通过IonS5TMXL高通量测序技术，研究间作甘薯、丹参和大豆条件下的烤烟根际土壤细菌群落的结构及多样性，探讨几种栽培措施对烤烟根际土壤细菌群落结构及多样性的影响。共获得3 667 900条有效序列，平均测序深度达76 415条有效数据，不同作物间作烤烟根际土壤均达96%以上，平均覆盖度达97.25%。表明，测序结果可反应样本的真实情况，该方法也可在包括烤烟在内的许多农作物领域应用。经Alpha多样性分析，不同作物间作烤烟根际土壤具有丰富的群落组成。烤烟不同生长发育阶段的根际土壤细菌群落丰富度和多样性存在一定的差异性，均在旺长期达最高，与前人的研究结果一致[18]。间作处理细菌群落丰富度高于单作烤烟处理(对照)，细菌群落多样性低于对照，与涂勇等[19]研究结果基本一致。

不同作物间作烤烟根际土壤样本在属水平上丰度位列前15的物种中，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、鞘脂菌属(Sphingobium)、未分类的甲烷球菌类(unidentifiedGammaproteobacteri)、Haliangium(属)、Devosia(属)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、马赛菌属(Massilia)，未分类的酸杆菌类(unidentifiedAcidobacteria)为优势菌属(相对丰度>1%)，与前人[20]研究结果相近。在门水平上，间作相较单作烤烟根际土壤微生物放线菌门的相对丰度降低，变形菌门和拟杆菌门的相对丰度提高。在属水平上，间作烤烟际土壤Devosia、Rhodanobacter、假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)相对丰度降低，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘脂菌属(Sphingobium)和未分类门的甲烷球菌的相对丰度提高。表明间作一定程度上改变了烤烟根际土壤微生物的群落结构。

在相同环境条件下，微生物群落的功能相似，但行使功能的微生物组成可能存在很大差异。表明，外界环境因子与土壤中微生物群落的功能组成之间的相关度大于外界环境因子与群落组成之间的相关度。所以，在分析土壤环境与微生物群落组成的基础上对揭示微生物群落的功能显得尤为重要。齐泽明等[21-23]研究发现，植物根系在植株生长发育过程中不断向周围释放大量的分泌物，这些次生代谢产物会改变根际环境，导致土壤微生物区系发生变化，并受植物生长发育阶段的影响。从采集到的土壤样品基于细菌群落16s RNA功能预测发现，随着烤烟生长发育进程的推进，行使代谢、遗传信息处理和有机系统的功能基因逐渐上升，在烤烟旺长期达最高，成熟期降低；环境信息处理和人类疾病与此相反，随烤烟生育时期逐渐降低，旺长期达最低，成熟期上升；细胞过程占比呈波动式变化，伸根期和成熟期上升，旺长期下降。推测：可能与烤烟根系在各生育时期的分泌物差异有关。间作处理中，行使代谢功能类别中编码萜类化合物、聚酮类化合物、异生素生物降解、脂质代谢和氨基酸代谢的功能基因减少；编码酶家族和糖的生物合成和代谢的功能基因有少量增加；行使遗传信息处理功能类别中编码翻译、折叠、分类和降解的功能基因减少；行使环境信息处理功能类别中编码细胞膜运输的功能基因增加；行使细胞过程类别中编码细胞运动的功能基因增加。可能是因为间作作物根系分泌的次生代谢产物导致周围土壤环境发生变化，即改变了烤烟根际土壤的微生物区系，从而影响根际土壤微生物群落的功能。此外，间作处理下烤烟根际群落结构及其功能随着生育期的推进，与单作烤烟根际群落结构及其功能变化趋同。说明，与间作因素相比，烤烟的生育期是影响根际群落结构及功能的主要因素。

研究结果基本揭示了烤烟与甘薯、丹参和大豆间作土壤细菌的多样性及其功能的变化，可为今后研究烤烟连作障碍提供参考，但由于研究中稀释曲线即测序深度并未达到饱和，处理中也还有部分细菌种群未被发现。因此，研究结果仅能代表各个土样中的大部分细菌种群，更深层次的研究仍有待开展。